Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

Les principaux avantages de ce protocole sont qu’il réduit les coûts d’étiquetage, améliore l’extraction des protéines et génère des données de haute qualité. Les principaux avantages de notre protocole sont l’efficacité élevée de l’étiquetage pour les différents types d’échantillons, sa reproductibilité et l’acquisition fiable de données. Après avoir isolé des échantillons de tissu musculaire quadriceps d’une souris euthanasiée selon un protocole approuvé par l’IACUC, peser 10 milligrammes de tissu musculaire et utiliser des pinces à épiler pour séparer les fibres musculaires.

Pour créer un lysate, transférer l’échantillon de tissu séparé dans un tube de deux millilitres contenant 200 microlitres d’une perle de silice zirconia millimétrique et 500 microlitres de tampon de lyse CHAPS. Placez les échantillons dans un perturbateur de perles et effectuez deux courses séquentielles de 45 secondes. Après le deuxième cycle, pour libérer la protéine liée à l’ADN, sonifier l’échantillon 10 fois pendant 10 secondes par sonication à une amplitude de 50 % avec des intervalles de 30 secondes sur la glace.

Après la dernière sonication, centrifugez le lysate et transférez le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Pour réduire/alkylating traitement des réacciens, transférer 200 microgrammes de protéines par condition dans de nouveaux tubes de centrifugeuse et utiliser tampon de lyse CHAPS frais pour apporter le volume final dans chaque tube jusqu’à 100 microlitres. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de TCEP à chaque tube et incubez les échantillons à 55 degrés Celsius pendant une heure.

À la fin de l’incubation, dissoudre neuf milligrammes d’iodoacétamide dans 132 microlitres de TEAB de 100 millimolaires et protéger la solution iodoacetamide de 375 millimolaires résultante de la lumière. Ajouter ensuite cinq microlitres d’iodoacétamide à chaque échantillon et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Pour les précipitations de méthanol/chloroforme, ajouter 400 microlitres de méthanol à chaque tranche de 100 microlitres de protéines et vortexer brièvement les échantillons.

Pour incorporer les liquides déposés sur les côtés des tubes de l’échantillon, centrifugez brièvement les échantillons et ajoutez 100 microlitres de chloroforme à chaque tube. Après un bref tourbillon, centrifugez rapidement les tubes à nouveau pour recueillir le liquide sur les côtés des tubes et ajouter 300 microlitres d’eau aux échantillons. Vortex vigoureusement pour obtenir des solutions homogènes et centrifuger les échantillons pendant une minute dans les mêmes conditions centrifugeuses.

À la fin de la centrifugeuse, transférer soigneusement les tubes sur une grille sans déranger les couches et retirer soigneusement le surnatant. Ajouter 300 microlitres de méthanol aux phases restantes de l’inter et du fond et vortexer les échantillons vigoureusement à nouveau. Centrifuger les échantillons pendant deux minutes et aspirer soigneusement les supernatants.

Ensuite, aspirez doucement autant de liquide de chaque échantillon que possible sous un jet d’air jusqu’à ce que les granulés soient juste un peu humides. Évaluer l’hydratation toutes les deux minutes pendant environ 10 minutes. Si nécessaire, les granulés peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités plus avant.

Pour digérer la protéine, réutilisez la pastille précipitée dans 100 microlitres de tampon de lyse TEAB et ajoutez 100 microlitres de solution de stockage de trypsine au fond d’un flacon de verre trypsine de 100 microgrammes. Après cinq minutes à température ambiante, ajouter 2,5 microlitres de la solution de trypsine fraîchement préparée par 100 microgrammes de protéines à chaque échantillon et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’étiquetage peptidique, dissoudre chaque flacon d’étiquette TMT de 0,8 milligramme avec 41 microlitres d’acétyonitrile anhydre par étiquette et incuber les réagencés pendant cinq minutes à température ambiante avec vortex occasionnel tout en gardant les étiquettes protégées de la lumière.

À la fin de l’incubation, centrifugez brièvement les flacons et ajoutez soigneusement 41 microlitres de réagenges d’étiquettes TMT à chaque échantillon de 100 microlitres pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étancher les réactions avec l’ajout de huit microlitres de 5% d’hydroxylamine pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, divisez les échantillons en aliquots égaux dans de nouveaux tubes de centrifugeuse pour le stockage à moins 80 degrés Celsius.

Dans cette acquisition représentative de données, 39 653 peptides totaux ont été analysés, dont 4 457 avaient des peptides égaux ou supérieurs à deux peptides uniques et 3 829 incluaient des ions reporter pour toutes les chaînes. Un seuil de changement de pli a été utilisé pour déterminer la distribution relative des protéines provenant de cellules malades par rapport aux cellules saines avec 296 protéines d’abondance significativement plus faible et 108 protéines d’abondance significativement plus élevée observées. L’analyse panther a montré une liste catégorisée de protéines basée sur une abondance significativement inférieure ou plus élevée de cellules malades en fonction de leur fonction moléculaire.

L’analyse des protéines d’une abondance significativement inférieure ou plus élevée a permis d’identifier de multiples interactions et de fortes associations entre les protéines. D’autres méthodes peuvent être utilisées pour identifier les interactions protéine-protéine, pour classer les interactions par groupes et pour identifier les interactions dans une variété de voies. Les techniques protéomiques sont des outils puissants dans les domaines de la recherche biomédicale pour comprendre les mécanismes du développement des maladies en fournissant des informations détaillées sur l’abondance des protéines.