Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Le protocole que nous présentons ici sera utile pour nous de comprendre comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune du système nerveux central. Avec cette méthode, les lymphocytes dans le cerveau peuvent être étudiés sur une base cellulaire. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres modèles et la maladie du système nerveux central qui avait besoin d’analyser les caractéristiques et les fonctions des cellules immunitaires.

Dans cette vidéo, le protocole peut facilement démontrer comment induire le modèle et isoler les cellules individuelles dans le cerveau. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, utilisez une seringue d’un millilitre pour injecter sous-cutanément des souris C57BL/6 anesthésiées avec 100 microgrammes de MOG émulsionné 35-55 dans 100 microlitres de l’adjuvant complet de Freund dans deux emplacements différents du dos près du cou. Le même jour et le deuxième jour après l’immunisation, injecter intraperitoneally les souris avec 200 microlitres d’un nanogramme par solution de travail de toxine de pertussis de microlitre.

Après la deuxième injection, transférez les souris dans leur cage d’origine avec un coussin chauffant et surveillez jusqu’à la pleine récumbence. Le lendemain et tout au long de la maladie, examiner et grade toutes les souris d’une manière aveuglée pour les signes neurologiques décrits dans le tableau et pour tout changement de poids. Au point de terminaison expérimental approprié, coupez soigneusement le crâne du nez au cou et transférez le cerveau de chaque animal de la boîte crânienne en tubes individuels de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu RPMI.

Bien mélanger les tubes pour enlever les globules rouges adhérents et enlever le milieu par aspiration. Ajouter 10 millilitres de milieu frais à chaque tube et transférer le cerveau dans des plats individuels de 100 millimètres. Enfin hacher chaque cerveau avec un rasoir et utiliser une pipette en plastique pour transférer autant de tissu d’un plat à la fois et six millilitres de milieu dans un homogénéiseur en verre centré de sept millilitres.

Moudre le cerveau à l’aide du piston lâche du pilon avant d’utiliser le piston serré pour apporter le tissu jusqu’à ce que la suspension soit homogène. Verser ensuite le lisier tissulaire qui en résulte dans un tube conique pré-refroidi de 15 millilitres sur la glace. Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, ajuster le volume de chaque tube à sept millilitres avec un milieu frais, avant d’ajouter chaque suspension tissulaire à un nouveau tube réfrigéré de 15 millilitres contenant trois millilitres de matrice membranaire 100% sous-sol par tube.

Mélanger par inversion à quelques reprises et utiliser une pipette de trois millilitres pour ajouter soigneusement et lentement une millilitre de solution de gradient de densité de 70 pour cent sous chaque échantillon de solution tissulaire. Séparez les cellules par centrifugation de gradient de densité et enlevez presque toute la couche supérieure, en prenant soin d’enlever complètement toute la myéline. Transférer l’interface dans un nouveau tube de 15 millilitres et ajuster le volume à 10 millilitres avec un milieu frais.

Puis centrifuger les échantillons à nouveau et enlever le supernatant avant de résuspendre les granulés dans environ 100 microlitres de milieu par tube. Pour l’analyse cytométrique de flux des cellules cérébrales récoltées, allouer environ deux fois 10 aux six cellules dans 100 microlitres de milieu dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits. Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, ajouter 100 microlitres de cocktail de stimulation cellulaire 500X plus inhibiteurs du transport des protéines aux puits et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.

À la fin de la piscine d’incubation, les cellules au fond des puits par centrifugation et réutilisent les granulés dans 100 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement par puits. Pré-incubation des cellules avec trois microlitres d’Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avant de tacher. Pour bloquer toute interaction non spécifique avec le Fc.

À la fin de l’incubation, ajouter le cocktail d’anticorps d’intérêt à chaque puits et placer l’assiette à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Après 30 minutes, laver les puits avec 100 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement par puits et sédimenter les cellules par centrifugation. Après avoir jeté les supernatants, ajouter 200 microlitres de tampon de fixation intracellulaire à chaque puits.

Après une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante, recueillir les échantillons par centrifugation et resuspendre les granulés dans 200 microlitres de tampon de perméabilité 1X par puits. Centrifugez les échantillons à nouveau, et après avoir jeté le supernatant, réutilisez les granulés dans 100 microlitres avec tampon de perméabilisation fraîche. Ensuite, ajoutez les anticorps appropriés pour la détection de tous les antigènes intracellulaires d’intérêt pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de tampon de perméabilisation 1X à chaque puits et faire tourner les échantillons par centrifugation. Ensuite, resuspendez les cellules de tache dans 200 microlitres de tampon de coloration de cytométrie d’écoulement et analysez les cellules par cytométrie de flux selon les protocoles standard. Un cours clinique typique d’EAE devrait avoir comme conséquence une courbe de maladie et le changement du poids corporel comme illustré.

Les souris C57BL/6 vaccinées avec mog 35-55 commencent habituellement à développer des symptômes de la maladie autour du jour 10 à 12 et atteignent le pic de la maladie autour du jour 15 à 21. Avant l’apparition de la maladie, le poids corporel des souris vaccinées augmente graduellement avant de diminuer en corrélation avec les symptômes croissants de la maladie Les souris démontrent le poids corporel le plus bas au sommet de l’EAE, avec des poids corporels se rétablissent légèrement à mesure que les symptômes cliniques diminuent. Les souris ne se rétablissent généralement pas complètement cependant et se développent typiquement une pathologie monophasique de maladie chronique.

Comme l’illustre cette analyse représentative du flux, les cellules Th11 et Th17 productrices d’interféron produisant du gamma sont considérablement augmentées chez les souris EAE. L’étape la plus importante est 3.10. L’opérateur doit transférer la couche moyenne et la lumière, en étant soigneusement, prendre aussi peu d’autres couches que possible.

En suivant ces protocoles, nous pouvons poursuivre les lymphocytes T pour une analyse plus poussée de la transcription