Name: Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et lévaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez l'induction de l'encéphalomyélite allergique expérimentale chez la souris et l'évaluation de la distribution des cellules immunitaires par cytométrie en flux et PCR quantitative. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la sclérose en plaques.

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Ce travail a été soutenu par le Groupe de formation à la recherche de la Fondation Else Kröner-Fresenius (EKFS) Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) et par le « Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt : Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung » du Land de Hesse.

ÉTHIQUE DÉCLARATION: Nos procédures expérimentales sont approuvées par le Comité d&#39;éthique du Regierungspräsidium Darmstadt (Allemagne) et confirment les réglementations nationales et européennes. Tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances des animaux et de réduire le nombre d&#39;animaux utilisés. 1. EAE Modèle <ol><li> Induction du modèle EAE <ol><li> Utilisez 10 à 13 semaines d&#39;âge 129S4 femme / SvJae × C57BL / 6 pour l&#39;induction de l&#39;EAE. </li><li> Donner à la souris une injection sous - cutanée, dans la partie supérieure et le bas du dos, de la MOG 35 encéphalitogénique - 55 (myéline oligodendrocyte glycoprotéine) peptide (200 ug), émulsionné dans 200 pi d&#39; adjuvant complet Freund`s (CFA) contenant 400 ug de Mycobacterium tuberculosis. Remarque: Comme, un contrôle négatif non-maladie induisant imposture, l&#39;adjuvant de Freund incomplet contenant Mycobacterium tuberculosis, dans le même volume et par la même voie, peut être utilisé. </li><li> TherEAprès, et de nouveau 24 heures plus tard, donne les souris une injection intrapéritonéale de toxine de la coqueluche (au total 0,2 pg, dilués dans 200 ul de solution saline tamponnée au phosphate, PBS). Utilisez les souris non traitées comme le groupe de contrôle, pour être en mesure de comparer les malades avec des animaux sains. Remarque: Il est également possible d&#39;induire l&#39; EAE avec 200 - 300 pg MOG 35 - 55 peptide, à 300 - 500 ug de Mycobacterium tuberculosis dans le CFA et 0,2 - 0,3 pg toxine pertussis dans un volume de 0,1 - 0,2 ml par injection. </li><li> A partir d&#39;une semaine après l&#39;injection, les souris examinent tous les jours pour les symptômes cliniques (voir étape 1.2.1) Remarque: Le jour de l&#39;apparition de la maladie varie selon les expériences, mais dans les conditions de notre laboratoire, c&#39;est d&#39;environ 11 jours et donc, ici le jour 14 est définie comme 3 jours après l&#39;apparition de la maladie. Toutes les souris dans la présente étude ont développé des symptômes cliniques. </li></ol></li><li> La notation des souris <ol><li> Classez symptômes cliniques par des scores cliniques comme suit:0) aucun signe, 0,5) paralysie distale de la queue, 1) paralysie complète de la queue, 1,5) queue molle et légère faiblesse des pattes arrières, 2) la queue molle et la faiblesse sévère des pattes postérieures, 2.5) queue molle et la paralysie de une patte arrière, 3) la queue molle et la paralysie des deux jambes de derrière, 3,5) paralysie des deux membres postérieurs et de la faiblesse d&#39;un membre antérieur (souris obtenant ce score ont été euthanasiés, conformément aux directives éthiques locales). </li></ol></li></ol> 2. Préparation des cellules simples pour l&#39;analyse de cytométrie en flux Remarque: Le mélange d&#39;anticorps se compose de 1 pl CD45-Vioblue, 2 pl CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 pl CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 ul CD11c -AlexaFluor700, 1 pl CD19-APC-H7 et 1 ul Ly6G-APC-Cy7. Remarque: Si vous prenez le sang, les ganglions lymphatiques, la rate et la moelle épinière, la procédure est la suivante: Les souris sont profondément anesthésiés avec une combinaison de isoflurane (2% en carbogène par minute) et la kétamine (100 mg / kg de poids corporel). Suivant ouvrir le thorax, retirer le sang avec un bâton intracardiaque et perfuser les souris intracardiaque avec du PBS froid. Ensuite, retirer les ganglions lymphatiques suivis par la rate et, enfin, la moelle épinière. Si vous ne devez perfuser les souris intracardiaque puis euthanasier les souris sous anesthésie profonde par luxation du cou. <ol><li> L&#39;isolement des splénocytes <ol><li> Anesthésier les souris avec une combinaison de l&#39;isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel). </li><li> zone d&#39;incision humide avec 80% d&#39;isopropanol afin d&#39;éviter toute contamination par des poils et ouvrir le thorax longitudinalement, sans perforer les tissus plus profonds, en utilisant des ciseaux. </li><li> Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23. Remarque: La rate est située dans le quadrant supérieur gauche de l&#39;abdomen sous la cage thoracique. Si seulement la rate est à étudier, cet organe peut être retiré avant la perfusion afin de Retain tous les types cellulaires d&#39;intérêt. </li><li> Retirer la rate et couper environ 1/8 et le peser. Conserver l&#39;échantillon dans PBS sur la glace. </li><li> Presser le tissu de la rate à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d&#39;un tube de 50 ml), en utilisant le piston d&#39;une seringue de 2 ml. </li><li> Laver la maille avec 5 ml de PBS. Centrifuger à 1800 xg pendant 3 min. Reprendre le culot dans 500 ul solution de lyse. Remarque: A ce stade, il peut être nécessaire de faire compter une cellule différentielle si, plus tard, une méthode d&#39;analyse de FACS alternative est utilisée qui n&#39;utilise pas des perles (voir section 3). </li><li> Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) et ajouter 500 ul de PBS. Centrifuger pendant 6 minutes à 650 xg à la température ambiante (RT). </li><li> Répéter l&#39;étape de lavage avec 500 ul de PBS. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) / PBS, ajouter 2 ul de Fc receptor-1 (FcRI) du tampon de blocage et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 13 ul unmélange tibody, incuber 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité, ajouter 500 ul de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. Jeter le surnageant. Remarque: La procédure de coloration du fabricant recommande un seul lavage, mais une réduction supplémentaire de la coloration de fond peut être obtenue par répéter éventuellement l&#39;étape de lavage une ou deux fois de plus. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS (tampon ou éventuellement en cours d&#39;exécution pour la séparation des protéines, afin de réduire potentiellement l&#39;agglutination des cellules) et le transférer à la cytométrie en flux tube. Gardez les cellules sur la glace. </li></ol></li><li> L&#39;isolement des cellules de ganglions lymphatiques <ol><li> Anesthésier les souris avec une combinaison de l&#39;isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel). </li><li> zone d&#39;incision humide avec 80% d&#39;isopropanol et d&#39;ouvrir le thorax longitudinalement avec des ciseaux. Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23. </li><li> Pour isoler le ganglion lymphatique inguinal, retirez soigneusement la peau dans la région du salutp et ramasser les ganglions lymphatiques soigneusement du tissu adipeux avec une pince. Peser le ganglion lymphatique inguinal et stocker l&#39;échantillon dans du PBS sur la glace. Remarque: Nous avons utilisé les ganglions lymphatiques inguinaux dans nos études parce O`Connor et al. ont constaté que le nombre élevé de monocytes activés, les macrophages, les neutrophiles et les lymphocytes T étaient présentes dans les ganglions lymphatiques inguinaux après l&#39; induction de l&#39; EAE 24. </li><li> Presser le ganglion lymphatique à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d&#39;un tube de 50 ml) en utilisant le piston d&#39;une seringue de 2 ml. </li><li> Laver la maille avec 5 ml de PBS. Centrifuger à 2400 xg pendant 8 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 ul de tampon de blocage FcRI et laisser incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 13 ul mélange d&#39;anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 pi de PBS (ou d&#39;un tampon approprié de roulement) et le transférerdans un tube de cytométrie de flux. </li></ol></li><li> L&#39;isolement des cellules sanguines <ol><li> Ajouter 50 pi 20 mM HEPES à 50 ul de sang (stabilisé avec de l&#39;EDTA) et ajouter 500 ul solution de lyse. Incuber pendant 10 min à température ambiante et ajouter 500 ul de PBS. Centrifuger pendant 6 minutes à 650 xg à température ambiante. Rejeter le surnageant et répéter l&#39;étape de lavage. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 ul de tampon de blocage FcRI et laisser incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 13 ul mélange d&#39;anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 pi de PBS et transférer dans le tube de cytométrie en flux. </li></ol></li><li> L&#39;isolement des cellules de moelle épinière <ol><li> Anesthésier les souris avec une combinaison de l&#39;isoflurane (2% en carbogène par minute) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel). </li><li> zone d&#39;incision humide avec 80% d&#39;isopropanol et d&#39;ouvrir le thorax longitudinalementen utilisant des ciseaux. Perfuser souris intracardiaque de froid pH PBS 7,0 23. </li><li> Mouiller la zone d&#39;incision sur le dos et faire à nouveau une coupe longitudinale avec un scalpel et enlever la peau. </li><li> Découpez la partie lombaire de la colonne vertébrale (qui innerve les membres postérieurs) et le rincer avec une seringue PBS-rempli pour extraire la moelle épinière. Découpez environ 1/3 de la moelle lombaire, peser cela et stocker l&#39;échantillon dans du PBS sur la glace. </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 2 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 500 ul solution de détachement cellulaire et HBSS (1: 1). Ajouter 3 mg / ml de collagénase A et 1 unité / ml d&#39;ADNase I, Decollato les cellules par répétées pipetage de haut en bas et incuber pendant 30 min avec agitation par secousses à 37 ° C, à 400 tours par minute. Remarque: Si l&#39;on préfère, la suspension cellulaire peut être débarrassé de contaminer la myéline et des débris cellulaires par centrifugation à gradient de densité qui peut améliorer la sensibilité de la mesure par cytométrie en flux, par conséquent, la réduction d&#39;un fond d&#39;autofluorescenceD le nombre d&#39;événements qui doivent être acquises (voir section 3.5). </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 2 min à température ambiante. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot dans 1 ml de 10% de sérum de veau foetal (FCS) / milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) et Decollato les cellules à nouveau en haut et en bas répété pipetage. </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 2 min à température ambiante. Répéter l&#39;étape de lavage. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS et comprimer la moelle épinière à travers un tamis à mailles de 70 pm (placé au-dessus d&#39;un tube de 50 ml) en utilisant le piston d&#39;une seringue de 2 ml. </li><li> Laver la maille avec 4 ml de PBS. Centrifuger à 1800 xg pendant 3 min à température ambiante. Jeter le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 100 ul de 0,2% de BSA / PBS, ajouter 2 pi FcRI réactif de blocage et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 13 ul mélange d&#39;anticorps, incuber 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité, ajoutez 500 pi de PBS et centrifuger pendant 6 min à 650 xg à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant, resuspendre le pelle cellulairet dans 500 ul de PBS (ou d&#39;un tampon approprié de roulement) et le transférer à la cytométrie en flux tube. </li></ol></li></ol> 3. Analyse par cytométrie en flux <ol><li> Titrer tous les anticorps au préalable pour déterminer les concentrations optimales comme décrit par Olesch et al. 25. </li><li> Utilisez des perles de compensation d&#39;anticorps de capture pour la compensation d&#39;une seule couleur pour créer multi-couleurs des matrices de compensation selon les instructions du fabricant. </li><li> Contrôler l&#39;étalonnage de l&#39;instrument à l&#39;aide quotidienne perles spécifiques selon les instructions du fabricant. </li><li> Directement avant la cytométrie en flux mesure, ajouter 30 ul cytométrie de débit standard de comptage absolu des cellules (pour l&#39;isolement voir la section 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) pour déterminer le nombre de cellules absolues. Au lieu d&#39;utiliser des billes de comptage des cellules peuvent être comptées. </li><li> Prenez des échantillons (cellules de la rate, les ganglions lymphatiques et le sang: 100.000 événements, la moelle épinière: 500.000 événements) dans un cytomètre unnd analyser en utilisant un logiciel spécifique de cytométrie de flux. <ol><li> Ouvrez le logiciel de cytométrie de flux et ajoutez fcs 3.0 fichiers en appuyant sur le bouton &quot;ajouter des échantillons&quot;. </li><li> Ouvrez le fichier ajouté en double-cliquant. Ajuster les canaux pour l&#39;axe X et l&#39;axe des y. Pour sélectionner les populations de cellules d&#39;intérêt créent une porte (voir la figure 4). </li></ol></li></ol> Analyse quantitative par PCR 4. <ol><li> L&#39;isolement de l&#39;ARNm et la transcription en ADNc <ol><li> Extraire l&#39;ARNm à partir de la moelle épinière lombaire (1/3), de la rate (1/8) et les ganglions lymphatiques inguinaux par le phénol-chloroforme et précipité avec de l&#39; éthanol à 26. <ol><li> Pour ce faire, l&#39;homogénéisation du tissu dans 1 ml de mélange de guanidinium thiocyanate-phénol, incuber pendant 10 min. Ajouter 200 ul de chloroforme et on incube à nouveau pendant 10 minutes. </li><li> Après une étape de centrifugation (18 000 g pendant 15 min à 4 ° C), laver la phase aqueuse supérieure est avec 500 ul d&#39;isopropanol et de centrifugation (18 000 g pendant 8 min à 4° C). </li><li> Laver le culot avec 500 ul d&#39;éthanol et, après une étape de centrifugation (18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C), on sèche le culot dans le concentrateur sous vide (5 min à 30 ° C). Par la suite, resuspendre le culot dans 30 ul d&#39;eau. </li></ol></li><li> Pour extraire l&#39;ARNm à partir de sang, centrifuger 500 ul d&#39;EDTA-sang stabilisé (300 x g 10 min 4 ° C). <ol><li> Prenez la couche leucocytaire, contenant des globules blancs, et diluer dans 1 ml de solution (150 mM NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4) lyser. </li><li> Après 10 minutes d&#39;incubation à la température ambiante, centrifuger les cellules à 650 g pendant 6 min et ensuite laver deux fois avec PBS. </li><li> Extraire l&#39;ARNm à partir de cellules de globules blancs (WBC) en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ARN selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Effectuer la synthèse d&#39;ADNc en utilisant un kit de synthèse d&#39;ADNc comprenant des hexamères aléatoires selon les instructions du fabricant. Utilisez 200 ng d&#39;ARNm pour le cdnUne synthèse. </li></ol></li><li> PCR quantitative <ol><li> Pour quantifier la quantité d&#39;un ARNm spécifique, utiliser 1 ul d&#39; ADNc, 1 uM avant / arrière amorce et un colorant de liaison selon les instructions du fabricant 27 ADN fluorescent. Voir le tableau 1 pour les séquences des jeux d&#39;amorces. Mesurer les valeurs de CT de l&#39;IL-1β, IL-6, IL-23, IFNy, TNFa et PPIA (peptidyl prolyl isomérase) en utilisant un système de PCR quantitative. </li><li> Pour déterminer l&#39;expression relative de l&#39; ARNm utiliser la méthode comparative CT (cycle seuil) 27. <ol><li> Pour ce faire , normaliser les valeurs Ct des gènes cibles aux niveaux de PPIA d&#39;expression en soustrayant la moyenne CT valeur de PPIA du gène cible, comme décrit dans les études précédentes (Barthelmes et al. , 28, Schiffmann et al. , 29, Schiffmann et al. 30). Par la suite, calculer les ΔΔCT valeurs que l&#39;on appelle, à l&#39;aide qui, à normaliser les ACt valeursdes gènes cibles provenant des souris EAE au niveau des gènes cibles des souris non traitées de l&#39;expression, de nouveau en soustrayant la moyenne ACt valeur chez les souris non traitées à partir de la valeur ACt chez des souris atteintes d&#39;EAE. </li><li> Pour obtenir l&#39;expression d&#39;ARNm relative du gène cible, calculer le taux à l&#39; aide de la formule suivante: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Testez la spécificité de chaque amorce. Déterminer la taille du fragment amplifié en utilisant un gel d&#39;agarose à 2% 31. La taille du fragment est représentée dans le tableau 1. </li></ol>

MJP est consultant chez Xellia et chez Leo Pharmaceuticals.

Le modèle EAE décrit ici a reçu le plus d&#39; attention comme un modèle de sclérose en plaques et est couramment utilisé pour tester des stratégies thérapeutiques pour MS 32. La maladie de la souris présente de nombreuses caractéristiques cliniques et histologiques de la sclérose en plaques et est provoquée par l&#39;induction d&#39;une auto-immunité à des antigènes neuronaux. La sensibilisation aux antigènes de la myéline est associée à un dysfonctionnement du cerveau du sang barrière et, par conséquent, l&...

la sclérose en plaques (MS) et son modèle d&#39;animal correspondant, encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), présentent des changements de la neuroinflammation auto-immunes du système nerveux central (SNC). Les lésions précoces de sclérose en plaques et EAE actives sont caractérisées par la présence de cellules immunitaires infiltrés. L&#39;étiologie de la SEP demeure inconnue, mais est largement considérée comme impliquant la destruction de la myéline médiée par les cellules T autoréactives. Ces cellules T autoréactives sécrètent des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines qui attirent d&#39;autres cellules immunitaires telles que les cellules B, les monocytes et les neutrophiles de la circulation. Les monocytes se différencient en macrophages. Interferon gamma (IFNy) sécrétée par la cellule T autoréactifs polarise les macrophages dans les macrophages pro-inflammatoires. Les cytokines pro-inflammatoires macrophages de libération et les espèces réactives de l&#39;oxygène qui favorisent l&#39;apoptose dans les oligodendrocytes. La mort des oligodendrocytes conduit à une démyélinisation. En outre, les cellules B se différencient en pcellules Lasma et autoanticorps de libération contre la gaine de myéline, en fin de compte résultant de la dégradation de la myéline. La perte de myéline entraîne une dégradation des axones et des neurones et ainsi à la formation de sites de lésion du SNC , qui représentent la principale caractéristique de la SP 1. Dans la périphérie, les cellules T et les cellules B sont activées dans les ganglions lymphatiques, ils prolifèrent dans la rate et migrent à travers la circulation dans le système nerveux central. Prolifèrent monocytes et neutrophiles dans la moelle osseuse et migrent également à travers la circulation dans le système nerveux central. Extravasation des leucocytes de la moelle osseuse, la rate et les ganglions lymphatiques dans le sang ou de la circulation sanguine dans le système nerveux central est un processus en plusieurs étapes qui dépend de plusieurs facteurs, y compris les interactions moléculaires entre les leucocytes et l&#39;endothélium médiées par des chimiokines et des récepteurs de chimiokines. La production de chimiokines par divers types de cellules peut être induit pendant le reactio immunitairen par des cytokines telles que le facteur onconécrosant-α (TNF), IFN - y et d&#39; interleukine-6 ​​(IL-6), qui recrute ensuite les cellules immunitaires vers le site de l&#39; inflammation 2,3. les cellules immunitaires présentent un sous-ensemble de récepteurs de chimiokine sur leur surface, en fonction du type de cellule et la voie de migration vers le site inflammatoire. Ainsi, CXCR2, CCR1 et CXCR1 sont exprimés sur les neutrophiles matures dans la moelle osseuse et le sang 4 et la liaison de ses ligands, CXCL2, CCL5 ou CXCL6, respectivement, active les neutrophiles et favorise leur adhérence à l&#39;endothélium et par la suite, la migration des cellules dans les tissus 5-9. CCL2 et CCL20 attirent les monocytes et les cellules Th1 / Th17 10, qui expriment CCR2 11 et CCR6 12, respectivement. CCR1 et CCR5 exprimés par différents types cellulaires, notamment les cellules T, les monocytes et les macrophages 13, se lient CCL3, CCL5 et CCL7 et qui sont régulés à la hausse au cours de MS 14. CXCR3 est exprimé sur les lymphocytes T et se lie CCL9, CCL10 etCCL11 15. Une stratégie principale dans le traitement de la SEP est la diminution des cellules du système immunitaire ou à la prévention de l&#39;infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central. Par conséquent, le blocage des récepteurs de chimiokines spécifiques a été étudiée dans l&#39;EAE. Antagonisme ou délétion génétique de 16 CCR1, CCR2 , 17, 18 CCR7 ou CXCR2 19 réduit EAE pathologie, alors que l&#39; antagonisme ou la deletion génétique de 20 CCR1, CXCR3 ou CCR5 20 21 ne réduisaient pas la pathologie. Par conséquent, l&#39;expression des récepteurs de chimiokine sur les leucocytes spécifiques est essentielle pour l&#39;infiltration de ce dernier dans le système nerveux central et dicte au cours de l&#39;EAE. L&#39;appauvrissement des cellules immunitaires est une stratégie de traitement efficace pour les patients atteints de SEP, puisque les cellules immunitaires infiltrés libèrent des cytokines, telles que TNFa, IL-6 et IL-1β, qui, à leur tour, favorisent le processus inflammatoire ou la dégradation des neurones 22. En outre, auto-les cellules Th1 réactives libèrent IFNy, qui à son tour stimule les macrophages à libérer TNFa, IL-1β et de l&#39;IL-23. Ce manuscrit décrit l&#39;induction de l&#39;EAE, la détermination de la distribution des cellules immunitaires et les niveaux de cytokines (ARNm) dans divers tissus chez des souris atteintes d&#39;EAE. Les cellules ont été isolés à différents moments au cours de la maladie afin de fournir une vue d&#39;ensemble en fonction du temps des processus inflammatoires qui conduisent finalement à la formation de lésions dans le SNC.

<table><tbody><tr><td>Système de détection de séquence ABI Prism 7500&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems, Austin, États-Unis</td><td></td><td>système de PCR quantitative</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Munich, Allemagne</td><td>A6964</td><td>solution de détachement cellulaire</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Francfort, Allemagne</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Francfort, Allemagne</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp ;</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>552843</td><td>billes de compensation</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Munich, Allemagne</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Étalon de comptage absolu cytométrique&nbsp ;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Allemagne</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Configuration du cytomètre et billes de suivi&nbsp ;</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Munich, Allemagne</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, États-Unis</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp ;</td><td>BioLegend, Fell, Allemagne</td><td>123114</td> Kit de synthèse d’ADNc <td></td></tr><tr><td>First Strand&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc receptor-1 bloquant le tampon&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Cytométrie en flux standard de comptage absolu</td><td>Polyscience, Eppelheim, Allemagne</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo v10&nbsp ;</td><td>Treestar, Ashland, États-Unis</td><td></td><td>Logiciel de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp ;</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td></td><td>Cytomètre en flux</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp ;</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Solution de lysinge&nbsp ;</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Allemagne</td><td>K0221</td><td>colorant fluorescent de liaison à l’ADN.</td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy&nbsp ;</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>74104</td><td>Kit d’extraction d’ARN</td></tr></tbody></table>

induction of experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l&#39;évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La sclérose en plaques est présumée être une maladie inflammatoire auto-immune qui se caractérise par la formation de lésions dans le système nerveux central (SNC), résultant en une déficience cognitive et motrice. encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal utile de la sclérose en plaques, car elle est aussi caractérisée par la formation de lésions dans le système nerveux central, un trouble moteur et est également entraîné par des réactions auto-immunes et inflammatoires. L&#39; un des modèles EAE est induite par un peptide dérivé de la protéine de myéline oligodendrocyte (MOG) 35-55 chez la souris. Les souris EAE développent un cours de maladie progressive. Ce cours est divisé en trois phases: la phase préclinique (jour 0-9), l&#39;apparition de la maladie (jour 10 - 11) et la phase aiguë (jour 12-14). Sclérose en plaques et l&#39;EAE sont induites par les lymphocytes T autoréactifs qui infiltrent le système nerveux central. Ces cellules T sécrètent des chimiokines et des cytokines qui conduit au recrutement d&#39;autres cellules immunitaires. Par conséquent, la distribution des cellules immunitaires dans la moelle épinière dendant les trois phases de la maladie a été étudiée. Pour mettre en évidence le point de la maladie à laquelle l&#39;activation / prolifération / accumulation de cellules T, les cellules B et les monocytes commence le temps, la distribution des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques, la rate et le sang a également été évaluée. En outre, les niveaux de plusieurs cytokines (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFNy) dans les trois phases de la maladie ont été déterminées, afin de mieux comprendre les processus inflammatoires de la maladie. En conclusion, les données fournissent un aperçu du profil fonctionnel des cellules immunitaires au cours EAE pathologie.

La figure 1 donne un aperçu schématique des différentes méthodes décrites dans cet article. 1) Les souris reçoivent une injection de MOG antigène 35-55 et développent des symptômes cliniques initiales après 10,7 ± 0,3 jours 28. Une évolution de la maladie représentant des souris EAE est représenté sur la figure 1. 2) Divers tissus (rate, ganglions lymphatiques, de la moelle épinière lombaire) et le ...

Ce manuscrit décrit les méthodes d’induction et de notation du modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE), ainsi que l’évaluation de la distribution des cellules immunitaires et des niveaux de cytokines à ARNm dans les ganglions lymphatiques, la rate, le sang et la moelle épinière à l’aide de la cytométrie en flux et de la PCR quantitative, respectivement, à diverses phases de la maladie.

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l&#39;évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

L'objectif général du modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou EAE, est de faciliter l'étude des mécanismes moléculaires potentiels sous-jacents au développement de la sclérose en plaques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sclérose en plaques, telles que : à quel stade de la maladie les cellules immunitaires pénètrent-elles dans le système nerveux central ? Le principal avantage de cette technique est que le modèle EAE reproduit de nombreuses caractéristiques majeures de la sclérose en plaques, telles que la démyélinisation et l'infiltration des cellules immunitaires.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie de la sclérose en plaques, car les médicaments testés selon cette méthode ont déjà été approuvés pour cette maladie. En général, les personnes novices dans cette méthode rencontreraient des difficultés, car il existe des conditions rigoureuses à prendre en compte lors de l'induction de l'EAE. Les souris doivent être maintenues dans un environnement sans stress, et une toxine de la coqueluche doit être préparée fraîchement.La démonstration officielle de cette méthode est essentielle, car l'isolement des ganglions lymphatiques et l'extraction de la moelle épinière sont difficiles à apprendre par la seule description. Commencez par injecter sous-cutanément chez des souris femelles âgées de 10 à 13 semaines 200 microgrammes de glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline, émulsionnés dans 200 microlitres d'adjuvant de Freund complet contenant 400 microgrammes de mycobactérie tuberculeuse.Injectez immédiatement et 24 heures plus tard les souris par voie intrapéritonéale avec 0,2 microgramme de toxine de la coqueluche dans 200 microlitres de PBS. Il est essentiel que les souris aient été habituées à la manipulation et à l'environnement expérimental avant l'induction de l'EAE, car le stress peut empêcher le développement de symptômes cliniques. Une semaine après l'injection, examinez quotidiennement les souris pour détecter les symptômes cliniques décrits dans le tableau.Pour évaluer la population de cellules immunitaires des ganglions lymphatiques induite par l'EAE, humidifiez la zone d'incision avec de l'isopropanol à 80 % au moment approprié après l'induction, puis retirez soigneusement la peau de la région fessière. À l'aide de pinces, extrayez délicatement le ganglion lymphatique inguinal du tissu adipeux. Pesez ensuite le ganglion et placez l'échantillon dans du PBS sur de la glace.Pour analyser les cellules de la moelle épinière, humidifiez le dos de l'animal avec de l'isopropanol, puis effectuez une incision longitudinale le long de la colonne vertébrale à l'aide d'un scalpel. Retirez ensuite la peau et disséquez la portion lombaire de la colonne vertébrale, qui innerve les membres postérieurs. Rincez la colonne vertébrale à l’aide d’une seringue remplie de PBS afin d’extraire la moelle épinière.Après avoir retiré environ 1/3 de la moelle lombaire, peser le fragment rachidien et conserver le tissu dans du PBS sur de la glace. Pour analyser la population de cellules immunitaires spléniques, ouvrir le tissu afin d'accéder à la partie inférieure de l'abdomen. Ensuite, retirer la rate et découper environ 1/8 du tissu.Peser le fragment de rate et conserver le tissu dans du PBS sur de la glace. Ensuite, utiliser le piston d'une seringue de deux mL pour macérer le reste du tissu à travers une passoire filtrante de 70 microns placée sur un tube de 50 millilitres, puis effectuer un lavage de la passoire avec cinq millilitres de PBS. Centrifuger les cellules filtrées.Resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon de lyse cellulaire, puis transférer les cellules dans un tube de 1,5 millilitre. Après 10 minutes à température ambiante, laver les cellules deux fois dans 500 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, resuspendre le culot dans 100 microlitres de BSA à 0,2 % dans le PBS, puis ajouter deux microlitres de tampon bloquant du récepteur Fc1 aux cellules.Après 15 minutes à l'obscurité à température ambiante, marquer les cellules avec 13 microlitres de cocktail d'anticorps pendant encore 15 minutes à température ambiante à l'obscurité. À la fin de l'incubation, laver les cellules au moins deux fois dans 500 microlitres de PBS, puis resuspendre le culot final dans 500 microlitres de PBS frais. Ensuite, transférer les cellules dans un tube de cytométrie en flux placé sur de la glace.Enfin, pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, ajouter directement avant la mesure 30 microlitres d'étalon absolu pour la cytométrie en flux aux cellules afin de déterminer les comptages cellulaires absolus. Puis analyser les échantillons sur le cytomètre en flux. Comme l'illustre cette figure, une augmentation transitoire de toutes les populations de cellules immunitaires au sein des ganglions lymphatiques est observée durant la phase aiguë de l'induction de l'EAE.Dans la rate cependant, seules les macrophages, les cellules B, les cellules T et les neutrophiles présentent une infiltration accrue. Dans le sang, toutes les populations de cellules immunitaires montrent une augmentation transitoire de leur circulation périphérique pendant la phase préclinique, ce qui correspond à une augmentation similaire, dépendante de la maladie, dans la moelle épinière lombaire durant la phase aiguë de la maladie, à l'exception de la population de monocytes, qui se différencient probablement en macrophages après leur entrée dans la moelle épinière. Ici, la stratégie de sélection des cellules pour l'évaluation des différentes populations cellulaires est présentée.Les nombres de cellules sont liés à la quantité de tissu ou de volume sanguin analysé, reflétant le nombre absolu de cellules. Dans les ganglions lymphatiques, l'expression de l'ARNm d'IL-23 augmente pendant la phase préclinique, tandis que l'expression d'IL-6 augmente de manière dépendante de la maladie. Dans la rate, l'expression d'IL-6 et d'IL-23 augmente durant la phase préclinique, alors que l'expression de l'ARNm d'IL-1 bêta n'est pas affectée avant le début de la maladie.Dans le sang, l'expression de l'ARNm de la seule TNF-alpha est augmentée, et ce de manière dépendante de la maladie. Dans la moelle épinière lombaire, la TNF-alpha, l'IL-1 beta et l'interféron gamma sont induits durant la phase aiguë, tandis que l'IL-6 est surexprimée uniquement durant la phase d'apparition de la maladie. Une fois maîtrisé, le modèle EAE, l'isolement cellulaire subséquent et l'analyse des effets peuvent être réalisés en huit heures pour dix souris, s'ils sont effectués correctement.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le Western Blot ou le ELISA peuvent être réalisées afin de confirmer les résultats de l'analyse d'expression des ARNm. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la sclérose en plaques pour explorer le mécanisme de démyélinisation dans le système nerveux central. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire le modèle EAE et de celle d'isoler les cellules immunitaires afin d'obtenir des résultats de cytométrie en flux reproductibles.N'oubliez pas que le travail avec l'adjuvant de Freund complet peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le relèvement de la peau de la souris et la vérification d'une pénétration cutanée complète par la seringue doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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