Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l'évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

L'objectif général du modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou EAE, est de faciliter l'étude des mécanismes moléculaires potentiels sous-jacents au développement de la sclérose en plaques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sclérose en plaques, telles que : à quel stade de la maladie les cellules immunitaires pénètrent-elles dans le système nerveux central ? Le principal avantage de cette technique est que le modèle EAE reproduit de nombreuses caractéristiques majeures de la sclérose en plaques, telles que la démyélinisation et l'infiltration des cellules immunitaires.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie de la sclérose en plaques, car les médicaments testés selon cette méthode ont déjà été approuvés pour cette maladie. En général, les personnes novices dans cette méthode rencontreraient des difficultés, car il existe des conditions rigoureuses à prendre en compte lors de l'induction de l'EAE. Les souris doivent être maintenues dans un environnement sans stress, et une toxine de la coqueluche doit être préparée fraîchement.

La démonstration officielle de cette méthode est essentielle, car l'isolement des ganglions lymphatiques et l'extraction de la moelle épinière sont difficiles à apprendre par la seule description. Commencez par injecter sous-cutanément chez des souris femelles âgées de 10 à 13 semaines 200 microgrammes de glycoprotéine oligodendrocytaire de la myéline, émulsionnés dans 200 microlitres d'adjuvant de Freund complet contenant 400 microgrammes de mycobactérie tuberculeuse.

Injectez immédiatement et 24 heures plus tard les souris par voie intrapéritonéale avec 0,2 microgramme de toxine de la coqueluche dans 200 microlitres de PBS. Il est essentiel que les souris aient été habituées à la manipulation et à l'environnement expérimental avant l'induction de l'EAE, car le stress peut empêcher le développement de symptômes cliniques. Une semaine après l'injection, examinez quotidiennement les souris pour détecter les symptômes cliniques décrits dans le tableau.

Pour évaluer la population de cellules immunitaires des ganglions lymphatiques induite par l'EAE, humidifiez la zone d'incision avec de l'isopropanol à 80 % au moment approprié après l'induction, puis retirez soigneusement la peau de la région fessière. À l'aide de pinces, extrayez délicatement le ganglion lymphatique inguinal du tissu adipeux. Pesez ensuite le ganglion et placez l'échantillon dans du PBS sur de la glace.

Pour analyser les cellules de la moelle épinière, humidifiez le dos de l'animal avec de l'isopropanol, puis effectuez une incision longitudinale le long de la colonne vertébrale à l'aide d'un scalpel. Retirez ensuite la peau et disséquez la portion lombaire de la colonne vertébrale, qui innerve les membres postérieurs. Rincez la colonne vertébrale à l’aide d’une seringue remplie de PBS afin d’extraire la moelle épinière.

Après avoir retiré environ 1/3 de la moelle lombaire, peser le fragment rachidien et conserver le tissu dans du PBS sur de la glace. Pour analyser la population de cellules immunitaires spléniques, ouvrir le tissu afin d'accéder à la partie inférieure de l'abdomen. Ensuite, retirer la rate et découper environ 1/8 du tissu.

Peser le fragment de rate et conserver le tissu dans du PBS sur de la glace. Ensuite, utiliser le piston d'une seringue de deux mL pour macérer le reste du tissu à travers une passoire filtrante de 70 microns placée sur un tube de 50 millilitres, puis effectuer un lavage de la passoire avec cinq millilitres de PBS. Centrifuger les cellules filtrées.

Resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon de lyse cellulaire, puis transférer les cellules dans un tube de 1,5 millilitre. Après 10 minutes à température ambiante, laver les cellules deux fois dans 500 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, resuspendre le culot dans 100 microlitres de BSA à 0,2 % dans le PBS, puis ajouter deux microlitres de tampon bloquant du récepteur Fc1 aux cellules.

Après 15 minutes à l'obscurité à température ambiante, marquer les cellules avec 13 microlitres de cocktail d'anticorps pendant encore 15 minutes à température ambiante à l'obscurité. À la fin de l'incubation, laver les cellules au moins deux fois dans 500 microlitres de PBS, puis resuspendre le culot final dans 500 microlitres de PBS frais. Ensuite, transférer les cellules dans un tube de cytométrie en flux placé sur de la glace.

Enfin, pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, ajouter directement avant la mesure 30 microlitres d'étalon absolu pour la cytométrie en flux aux cellules afin de déterminer les comptages cellulaires absolus. Puis analyser les échantillons sur le cytomètre en flux. Comme l'illustre cette figure, une augmentation transitoire de toutes les populations de cellules immunitaires au sein des ganglions lymphatiques est observée durant la phase aiguë de l'induction de l'EAE.

Dans la rate cependant, seules les macrophages, les cellules B, les cellules T et les neutrophiles présentent une infiltration accrue. Dans le sang, toutes les populations de cellules immunitaires montrent une augmentation transitoire de leur circulation périphérique pendant la phase préclinique, ce qui correspond à une augmentation similaire, dépendante de la maladie, dans la moelle épinière lombaire durant la phase aiguë de la maladie, à l'exception de la population de monocytes, qui se différencient probablement en macrophages après leur entrée dans la moelle épinière. Ici, la stratégie de sélection des cellules pour l'évaluation des différentes populations cellulaires est présentée.

Les nombres de cellules sont liés à la quantité de tissu ou de volume sanguin analysé, reflétant le nombre absolu de cellules. Dans les ganglions lymphatiques, l'expression de l'ARNm d'IL-23 augmente pendant la phase préclinique, tandis que l'expression d'IL-6 augmente de manière dépendante de la maladie. Dans la rate, l'expression d'IL-6 et d'IL-23 augmente durant la phase préclinique, alors que l'expression de l'ARNm d'IL-1 bêta n'est pas affectée avant le début de la maladie.

Dans le sang, l'expression de l'ARNm de la seule TNF-alpha est augmentée, et ce de manière dépendante de la maladie. Dans la moelle épinière lombaire, la TNF-alpha, l'IL-1 beta et l'interféron gamma sont induits durant la phase aiguë, tandis que l'IL-6 est surexprimée uniquement durant la phase d'apparition de la maladie. Une fois maîtrisé, le modèle EAE, l'isolement cellulaire subséquent et l'analyse des effets peuvent être réalisés en huit heures pour dix souris, s'ils sont effectués correctement.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le Western Blot ou le ELISA peuvent être réalisées afin de confirmer les résultats de l'analyse d'expression des ARNm. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la sclérose en plaques pour explorer le mécanisme de démyélinisation dans le système nerveux central. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire le modèle EAE et de celle d'isoler les cellules immunitaires afin d'obtenir des résultats de cytométrie en flux reproductibles.

N'oubliez pas que le travail avec l'adjuvant de Freund complet peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le relèvement de la peau de la souris et la vérification d'une pénétration cutanée complète par la seringue doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.