Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l'évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Ce manuscrit décrit les méthodes d’induction et de notation du modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE), ainsi que l’évaluation de la distribution des cellules immunitaires et des niveaux de cytokines à ARNm dans les ganglions lymphatiques, la rate, le sang et la moelle épinière à l’aide de la cytométrie en flux et de la PCR quantitative, respectivement, à diverses phases de la maladie.

L’objectif global du modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune, ou EAE, est de faciliter l’étude des mécanismes moléculaires potentiels sous-jacents au développement de la sclérose en plaques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sclérose en plaques, telles que : à quel stade de la maladie les cellules immunitaires s’infiltrent-elles dans le système nerveux central ? Le principal avantage de cette technique est que le modèle EAE imite bon nombre des principales caractéristiques de la sclérose en plaques, telles que la démyélinisation et l’infiltration des cellules immunitaires.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la sclérose en plaques, car des médicaments testés avec cette méthode ont déjà été approuvés pour cette maladie. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auraient du mal parce qu’il existe des conditions approfondies qui doivent être prises en considération lors de l’induction de l’EAE. Les souris doivent être gardées dans un environnement sans stress et une toxine de la coqueluche doit être fraîchement préparée.

La démonstration officielle de cette méthode est essentielle car l’isolement des ganglions lymphatiques et l’extraction de la moelle épinière sont difficiles à apprendre par la seule description. Commencez par injecter par voie sous-cutanée à des souris femelles âgées de 10 à 13 semaines 200 microgrammes de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline. émulsionné dans 200 microlitres d’adjuvant de Freund complet, contenant 400 microgrammes de Mycobacterium tuberculosis.

Immédiatement et 24 heures plus tard, injectez par voie intrapéritonéale aux souris 0,2 microgramme de toxine coqueluche dans 200 microlitres de PBS. Il est essentiel que les souris aient été adaptées à la fois à la manipulation et à l’environnement expérimental avant l’induction de l’EAE pour induire un stress qui peut empêcher le développement de symptômes cliniques. Une semaine après l’injection, examinez les souris tous les jours pour détecter les symptômes cliniques décrits dans le tableau.

Pour évaluer la population de cellules immunitaires des ganglions lymphatiques induite par l’EAE, au moment approprié après l’induction, mouillez la zone d’incision avec 80 % d’isopropanol et retirez soigneusement la peau sur la région de la hanche. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement le ganglion lymphatique inguinal du tissu adipeux. Ensuite, pesez le nœud et placez l’échantillon dans le PBS sur de la glace.

Pour analyser les cellules de la moelle épinière, mouillez le dos de l’animal avec de l’isopropanol et utilisez un scalpel pour faire une coupe longitudinale de la colonne vertébrale. Ensuite, retirez la peau et disséquez la partie lombaire de la colonne vertébrale, en innervant les membres postérieurs. Rincer la colonne vertébrale avec une seringue remplie de PBS pour extraire la moelle épinière.

Après avoir retiré environ 1/3 de la moelle lombaire, pesez le fragment de colonne vertébrale et stockez le tissu dans le PBS sur de la glace. Pour analyser la population de cellules immunitaires spléniques, ouvrez le tissu pour accéder à la partie inférieure de l’abdomen. Ensuite, retirez la rate et coupez environ 1/8 du tissu.

Pesez le fragment de rate et stockez le tissu dans du PBS sur de la glace. Ensuite, utilisez le piston d’une seringue de deux ml pour faire macérer le reste du tissu à travers un tamis à mailles de 70 microns sur un tube de 50 millilitres, suivi d’un lavage PBS de cinq millilitres de la passoire. Centrifuger les cellules filtrées.

Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse cellulaire et transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre. Après 10 minutes à température ambiante, lavez les cellules deux fois dans 500 microlitres de PBS. Après le deuxième lavage, remettez en suspension la pastille dans 100 microlitres de BSA 0,2 % dans PBS, et ajoutez deux microlitres de récepteur Fc un tampon bloquant aux cellules.

Après 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante, étiquetez les cellules avec 13 microlitres de cocktail d’anticorps pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, lavez les cellules au moins deux fois dans 500 microlitres de PBS et remettez en suspension la pastille finale dans 500 microlitres de PBS frais. Transférez ensuite les cellules dans un tube de cytométrie en flux sur de la glace.

Enfin, pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, directement avant la mesure par cytométrie en flux, ajoutez 30 microlitres d’étalon de comptage absolu de cytométrie en flux aux cellules pour déterminer le nombre absolu de cellules. Analysez ensuite les échantillons sur le cytomètre en flux. Comme l’illustre cette figure, une augmentation transitoire de toutes les populations de cellules immunitaires à l’intérieur des ganglions lymphatiques est observée pendant la phase aiguë de l’induction de l’EAE.

Dans la rate, cependant, seuls les macrophages, les lymphocytes B, les lymphocytes T et les neutrophiles présentent une augmentation de l’infiltration. Dans le sang, toutes les populations de cellules immunitaires présentent une augmentation transitoire de leur circulation périphérique au cours de la phase préclinique qui correspond à une augmentation similaire de la moelle épinière lombaire dépendante de la maladie pendant la phase aiguë de la maladie, à l’exclusion de la population monocytaire, qui se différencie probablement en macrophages après l’entrée dans la moelle épinière. Ici, la stratégie de contrôle pour l’évaluation des différentes populations cellulaires est présentée.

Le nombre de cellules est lié à la quantité de tissu ou au volume sanguin analysé, reflétant le nombre absolu de cellules. Dans les ganglions lymphatiques, l’expression de l’ARNm de l’IL-23 est augmentée pendant la phase préclinique, tandis que l’expression de l’IL-6 augmente de manière dépendante de la maladie. Dans la rate, l’expression de l’IL-6 et de l’IL-23 augmente dans la phase préclinique, tandis que l’expression de l’ARNm bêta de l’IL-1 n’est pas affectée avant le début de la maladie.

Dans le sang, l’expression de l’ARNm uniquement du TNF-alpha est régulée à la hausse et dépendante de la maladie. Dans la moelle épinière lombaire, le TNF-alpha, l’IL-1 bêta et l’interféron gamma sont induits pendant la phase aiguë, tandis que l’IL-6 est régulée à la hausse pendant la phase d’apparition de la maladie uniquement. Une fois maîtrisé, le modèle EAE, l’isolement cellulaire ultérieur et l’analyse des effets peuvent être complétés en huit heures pour dix souris s’ils sont effectués correctement.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le Western Blot ou l’ELISA peuvent être effectuées pour confirmer les résultats de l’analyse de l’expression de l’ARNm. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la sclérose en plaques pour explorer le mécanisme de démyélinisation dans le système nerveux central. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire le modèle EAE et d’isoler les cellules immunitaires pour obtenir des résultats de cytométrie en flux reproductibles.

N’oubliez pas que travailler avec un adjuvant de Freund complet peut être extrêmement dangereux, et ajoutez des précautions telles que soulever la peau de la souris et assurer une pénétration complète de la peau par la seringue doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.