Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Cette procédure permet aux chercheurs sur les moustiques d’aborder facilement la capacité de reproduction de leurs moustiques au niveau individuel. Comparé aux méthodes conventionnelles, ce protocole réduit considérablement le temps, l’espace et le travail nécessaires pour tester la fécondité et la fertilité des moustiques au niveau individuel. Commencez par préparer des plaques pour l’expérience de ponte.

Forez quatre à six trous par puits dans le couvercle d’une plaque de culture de 24 puits à l’aide d’une foreuse domestique avec un trépan de 1,6 millimètre. Un jour avant l’expérience, lavez et rincez les plaques et faites-les tremper dans 1% à 5% d’eau de Javel pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez soigneusement les plaques sous de l’eau déionisée courante et séchez-les.

Faire fondre 2 % d’agarose dans de l’eau désionisée et ajouter immédiatement 500 microlitres de l’agarose fondue à chaque puits d’une plaque de 24 puits. Laissez les plaques sur le banc du laboratoire pendant la nuit pour assécher toute condensation. Au moins 16 heures avant l’alimentation par le sang, retirez toute source d’eau ou de sucre des moustiques femelles.

Le jour de l’alimentation, chauffer un circulateur d’eau à 37 degrés Celsius et nourrir les moustiques avec du sang vertébré placé dans des mangeoires artificielles pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, transférez les moustiques dans un plat en verre sur glace. Sélectionnez ceux qui sont engorgés de sang et placez-les dans un récipient contenant 30% d’eau saccharose.

Comptez au moins 72 heures pour que les femelles terminent l’excrétion et le développement des œufs. Environ une heure avant de transférer les moustiques sur la plaque de 24 puits, utilisez une pipette de transfert pour ajouter deux à trois gouttes d’eau dans chaque puits. Abattre les moustiques avec du dioxyde de carbone et les transférer dans un plat en verre sur de la glace.

Ensuite, placez individuellement chaque moustique sur un couvercle inversé de la plaque de 24 puits. Une fois que les 24 moustiques ont été placés, couvrez le couvercle avec un fond de plaque inversé, fixez-le avec un nouvel élastique frais et placez-le dans une chambre environnementale jusqu’à ce que les moustiques se rétablissent. Ensuite, tournez la plaque vers le haut à droite.

Laissez les moustiques femelles ponder pendant 24 à 48 heures. Ensuite, retirez les femelles en les libérant des plaques dans une grande cage. Avant de compter les œufs, vérifiez chaque puits pour les œufs qui se trouvent sur les parois du puits et à la marge de la surface de l’agarose et du plastique où ils sont difficiles à résoudre sur les photos.

Utilisez un pinceau humide pour déplacer ces œufs vers la surface plane afin que tous les œufs soient dans un plan uniforme et ne se chevauchent pas. Utilisez une pince pour enlever les jambes, les ailes et les autres particules cassées dans les puits qui peuvent interférer avec l’imagerie des œufs. Réglez un appareil photo numérique compact en mode microscope, ce qui permet à l’utilisateur de se concentrer sur des objets aussi proches que d’un centimètre et de prendre une image de chaque puits.

Après avoir photographié chaque puits d’une plaque, prenez une image de la plaque entière. Utilisez une étiquette d’ordre d’imagerie pour distinguer chaque plaque ultérieurement. Ajoutez environ cinq gouttes d’eau à chaque puits pour empêcher son bouchon d’agarose et les œufs de sécher et pour induire le développement et l’éclosion de l’embryon.

Transférez les images sur un ordinateur et renommez les fichiers avec la plaque et les bons d’identification pour faciliter l’organisation. Ouvrez les images avec ImageJ et utilisez l’outil Multi-point pour marquer chaque œuf, en zoomant ou en arrière pour compter les touffes d’œufs. Après avoir marqué tous les œufs, double-cliquez sur l’icône Multi-points pour afficher le nombre de repères et enregistrer les résultats dans une feuille de calcul.

Commencez à ajouter de la nourriture aux puits qui contiennent des larves écloses dès qu’elles apparaissent. Environ cinq à huit jours plus tard, anesthésiez les larves en recouvrant la plaque de glace concassée pendant 15 à 20 minutes. Insérez un matériau noir sous la plaque pour améliorer le contraste et prendre des images de chaque puits tout en gardant les plaques sur la glace.

Après avoir photographié chaque puits, prenez une image de la plaque entière avec une étiquette d’ordre d’imagerie. Ouvrez les images avec ImageJ et utilisez l’outil multi-points pour compter les larves. Les larves peuvent varier en forme, en angle et en concentration.

Excluez les cuticules excrétées, qui ressemblent à des larves à tête seule avec un peu de corps, ou à des larves rétrécies. Enregistrez les résultats dans la feuille de calcul. Les moustiques ont été injectés avec de l’ARN double brin ciblant un transporteur de fer candidat, feT, ou un gène de contrôle, EGFP.

Ensuite, ils ont été nourris au sang et mesurés pour la fécondité et la production de fertilité en utilisant la méthode de la plaque Eagle. Les moustiques chez lesquels l’expression du transporteur de fer a été réduite au silence ont montré une réduction significative du nombre d’œufs et du taux d’éclosion. les moustiques FeT-silencieux ont également montré l’excrétion retardée et les oeufs petits et de couleur claire.

Prendre de bonnes photos est une étape critique pour cette méthode car la qualité des images et la quantité d’œufs ou de larves individuels affectent directement la qualité des résultats.