Mesurer le stress oxydatif Résistance Caenorhabditis elegans En 96 plaques de microtitration bien

L’objectif global de cette procédure est de mesurer le stress oxydatif, la résistance du céno Titis élégance, les nématodes en liquide. Ceci est accompli en dissolvant d’abord les agents inducteurs de ROS tels que le paraquat dans le tampon M neuf et Ali citant la solution et une plaque de microtitration de 96 puits. La deuxième étape consiste à transférer cinq à huit nématodes synchronisés de L tardive à quatre dans chaque puits en utilisant au moins 12 puits par condition.

Ensuite, à l’aide d’un microscope à dissection, le nombre d’animaux vivants et morts est déterminé toutes les heures jusqu’à ce que la plupart des animaux soient morts. La dernière étape consiste à calculer le pourcentage d’animaux qui ont survécu à chaque point temporel pour chaque condition au moins six jours avant d’effectuer l’essai de résistance au stress oxydatif. Préparez le mélange sec modifié young grins only bact PEPIN ou MYOB pour bien mélanger le milieu MYOB en secouant.

Pour préparer un litre de milieu MYOB, combinez six grammes de mélange sec MYOB avec 17 grammes de gélose et préparez jusqu’à un litre avec un autoclave H2O pendant 45 minutes à 122 degrés Celsius. Versez le milieu MYOB dans des assiettes et laissez sécher les plaques à température ambiante pendant deux jours en utilisant des techniques stériles. Inoculez 100 millilitres de milieu de bouillon LB avec des bactéries e coli, OP 50 et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain.

Les plaques MYOB avec la bactérie E coli OP 50 permettent à la bactérie de se développer à température ambiante pendant 48 heures. Dans les cas où la régulation négative des gènes sera accomplie par l’interférence de l’ARN, commencez la procédure en préparant des plaques d’alimentation M-Y-O-B-R-N-A-I. Après l’autoclavage, le milieu MYOB lui permet de refroidir à environ 55 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite de l’isopropyl bêta D, un peroxyde de thito, ou IPTG et de l’ampicilline au milieu MYOB. Versez les assiettes et laissez-les sécher à température ambiante pendant deux jours streak E coli HT un 15. Bactéries sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline et de la tétracycline.

Une souche a été transformée avec un plasmide qui exprime le vecteur vide de contrôle ou ev. Une autre souche a été transformée avec un plasmide qui exprime l’ARN double brin qui cible celui de FOLLIN. Mr.NA poussent pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain.

Choisissez des colonies et inoculez un milieu LB contenant de l’ampicilline. Faites pousser les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Voir les plaques MYOB RNAi avec des bactéries e coli HT one 15 EV ou HT one 15 Collin one RNAi : conservez les plaques à température ambiante pendant 48 heures avant utilisation.

Préparez plusieurs plaques en fonction du nombre de vers nécessaires pendant le test et laissez les vers pondre des œufs pendant six heures à 20 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un pic à vis sans fin en platine pour retirer les mères. Vérifiez les plaques au microscope pour évaluer le nombre d’œufs pondus.

Laissez les œufs éclore et les vers pousser à 20 degrés Celsius pendant 48 heures. 48 heures plus tard, les animaux devraient être à la fin du stade L quatre ou au stade de jeune adulte. Notez que l’incubation de 48 heures ne s’applique qu’aux mutants qui grandissent de la même manière que les animaux de type sauvage.

Si un nouveau mutant doit être testé, il est important de surveiller d’abord son taux de développement. Dans cette démonstration, le stress oxydatif sera induit à l’aide de paraquat. Préparez une solution fraîche de paraquat de 100 millimolaires comme décrit dans le texte du protocole d’accompagnement.

Le paraquat est un composé dangereux et hautement toxique qui doit être manipulé conformément aux directives appropriées. Pipette 40 microlitres de la solution de paraquat à chaque puits d’un 96. Plaque de puits : utilisez au moins 12 puits comme répliques de chaque condition testée à l’aide d’un pic à vis sans fin en platine.

Transférez cinq à huit L quatre larves d’animaux dans chaque puits, indiquez l’heure de début et l’heure de fin pour chaque condition testée, placez la plaque de 96 puits à 20 degrés Celsius une heure après l’heure de début, marquez les animaux morts et vivants à l’aide d’un microscope à dissection, secouez doucement la plaque avant de commencer à compter. Les vers qui ne bougent pas même après avoir repéré une lumière de haute intensité sont considérés comme morts. Observez la forme des vers et le mouvement de la tête à fort grossissement pour distinguer les vers morts des vers vivants.

Évaluez la survie toutes les heures jusqu’à ce que la plupart des vers soient morts, et répétez ce test au moins trois fois indépendamment pour déterminer le pourcentage de survie pour chaque point temporel. Tout d’abord, calculez le nombre total d’animaux par condition en ajoutant le nombre total d’animaux transférés à chacune. Eh bien, ignorez les animaux qui ont été endommagés ou tués.

Transfert suivant pour chaque point temporel. Calculez le nombre total d’animaux morts par condition. Calculez le pourcentage de décès et le pourcentage de survie dans cette étude.

100 millimolaires. Le paraquat a été utilisé pour déterminer la résistance de l’élégance sauvage de type C par rapport à un mutant de follin qui s’est avéré résistant au stress oxydatif, à la chaleur et à l’anoxie. Après quatre heures de traitement, 48,3 % des animaux sauvages ont survécu, contre 77,8 % chez les animaux mutants.

Des résultats similaires ont été obtenus dans une comparaison entre des animaux de type sauvage nourris avec des animaux témoins, des vecteurs vides ou des follins. Une bactérie ARNi, la régulation négative de follin, une utilisation de l’ARNi a augmenté la résistance à 100 millimolaires de paraquat, démontrant que la régulation négative de la fonction des gènes à l’aide de l’ARNi imite la perte de mutations de la fonction. Une fois maîtrisée, cette technique peut être facilement réalisée pour déterminer les gènes qui modifient la résistance au stress oxydatif et voir l’élégance. Et enfin, la réalisation de ces dépistages et voir l’élégance a une grande valeur et un grand potentiel dans le traitement des maladies humaines liées au stress oxydatif.