Name: Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour mesurer rapidement les interactions ligand-récepteur trans dans des cellules HEK-293T. Cette technique permet d'évaluer les effets des mutations sur l'adhésion protéique en neurobiologie.

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Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Institute of Mental Health (R00MH103531 et R01MH116901 à J.A.), une subvention de formation prédoctorale du National Institute of General Medicine (T32GM007635 à S.R.), et une bourse Lyda Hill Gilliam pour l’étude avancée (GT11021 à S.R.). Nous remercions le Dr Kevin Woolfrey pour son aide au microscope, le Dr K Ulrich Bayer pour l’utilisation de son microscope épifluorescent et Thomas Südhof (Stanford University) pour le plasmide LRRTM2.

1. Culture cellulaire et transfection
<ol><li>Faire des médias cellulaires HEK avec DMEM, 1x (Modification de Dulbecco de Eagle’s Medium) complété par 4,5 g/L de glucose, L-glutamine & pyruvate de sodium et 10% FBS. Filtre stérile.</li>
	<li>Prédéterminer les ligands et les récepteurs appropriés pour l’analyse d’agrégation. REMARQUE : Neurexin3α SS4+/- et l’un de ses ligands connus, LRRTM2, ont été utilisés dans cette étude. Ligands et récepteurs d’intérêt ont été exprimés des CDNA dans pcDNA3.1. Un assemblage Gibson a été utilisé pour insérer Neurexin3α dans pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGCGCCCCCCATGAGCTTTACCCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Préparer les cellules HEK293T.<ol>
<li>Faire pousser les cellules HEK293T à la confluence dans un flacon T-75.</li>
		<li>Une fois confluent, utiliser 2 mL de trypsine et placer dans un incubateur de 37 °C pendant 2 min. Ajouter 6 mL de médias HEK au flacon pour résusquer les cellules et transférer les 8 mL dans un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Granulé à 500 x g pendant 5 min et résuspendez dans les médias cellulaires HEK pour un total de 8 mL.</li>
		<li>Comptez les cellules et ajoutez 735 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Réglez le volume final à 2 mL pour chaque puits à l’aide de supports cellulaires HEK.</li>
		<li>Placer dans un incubateur à 37 °C et permettre aux cellules de croître pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 50 à 60 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellules transfect HEK293T utilisant la méthode de phosphate de calcium13.<ol>
<li>Transfect bien-1 avec 3 μg de la protéine d’intérêt et co-transfect avec 1 μg de protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- et 1 μg de mCherry).</li>
		<li>Transfect bien-2 comme dans l’étape 1.4.1. mais avec la protéine mutée d’intérêt (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>Transfect bien-3 avec 3 μg du ligand d’intérêt et co-transfect avec 1 μg d’une autre protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 et 1 μg de GFP).</li>
		<li>Transfect bien-4 et bien-5 pour servir de contrôles négatifs: bien-4 avec 1 μg de GFP et bien-5 avec 1 μg de mCherry.</li>
		<li>Préparer une autre plaque (comme à l’étape 1.4.1-1.4.4) si vous avez besoin de conditions ou de commandes supplémentaires (Neurexin3αWT/A687T SS4+). REMARQUE : L’efficacité de transfection est analysée 24 h après transfection sous un microscope d’épifluorescence et quantifiée comme nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente avec laquelle elles ont été transfectées. Une approche plus rationalisée comprendrait la transfection des cellules HEK avec un codage vectoriel bicisronique pour une protéine fluorescente et le ligand d’intérêt et est fortement recommandé au-dessus de la co-transfection. Dans le cas de cette étude, les néurexines alpha sont ~4.3 kb et l’intensité de fluorescence basse a été observée utilisant un système bicistronic nécessitant la co-transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>48 heures après la transfection, récolter les cellules pour l’agrégation.<ol>
<li>Lavez-les deux fois avec du PBS.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 10 mM d’EDTA dans chaque puits pour dissocier délicatement les interactions cellule à cellule et incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min. REMARQUE : La trypsine n’est pas recommandée pour l’étape 1.5.2 en raison du clivage protéolytique potentiel des molécules d’adhérence dans l’étude. En outre, après l’ajout EDTA le protocole ne peut pas être arrêté jusqu’à ce que l’achèvement que les cellules seront maintenant exposés à des conditions ambiantes.</li>
		<li>Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules et récoltez chacune bien dans des tubes coniques séparés de 15 mL.</li>
		<li>Tubes coniques centrifugeuses à 500 x g et température ambiante pendant 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Pendant que les cellules sont granulées, préparez 6 tubes d’incubation en étiquetant le dessus de chaque tube de microcentrifugeuse à chaque condition. REMARQUE : Chaque permutation des conditions GFP et mCherry doit être utilisée pour englober toutes les conditions expérimentales et les contrôles appropriés. Par exemple: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- -mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2—GFP. Fabriquer des tubes supplémentaires pour répondre à d’autres conditions et contrôles.</li>
	<li>Retirer les cellules supernatantes et résuspendantes dans 500 μL de supports HEK avec 10 mM CaCl2 et 10 mM MgCl2 réchauffés à 37 °C. REMARQUE : L’ajout de CaCl2 et de MgCl2 permet aux molécules d’adhérence de rétablir la liaison et n’est nécessaire que si les partenaires d’interaction transcellulaire en question nécessitent des cations divalentes pour l’adhérence.</li>
	<li>Comptez les cellules dans chaque tube conique de 15 mL à l’aide d’un hémocytomètre et aliquot 200.000 cellules de chaque condition dans le tube approprié de l’étape 1.6.1 pour un mélange 1:1 dans un volume total de 500 μL. REMARQUE: Il ne devrait prendre que 5 min par condition pour compter et aliquot quantités.</li>
	<li>Incuber les tubes à température ambiante dans un rotateur à tube lent.</li>
</ol>2. Acquisition d’images
<ol><li>Optimisez les paramètres d’acquisition du microscope pour des échantillons spécifiques. Dans cet exemple, des images ont été prises sur un microscope à champ large. Utilisez un objectif 5x air (NA: 0.15; DEO: 20000 μm) pour obtenir un champ assez grand pour l’analyse.</li>
	<li>Évaluer l’agrégation de base immédiatement après le mélange des deux conditions des cellules HEK à l’étape 1.8. Ce sont maintenant les images « temps zéro ».<ol>
<li>Pipette 40 μL de chaque mélange d’échantillon sur une lame de microscope chargée et l’image sous fluorescence dans les canaux 488 et 561.</li>
		<li>Acquérir trois champs de vision différents à un seul plan de mise au point par goutte d’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtenez des images finales à 60 min sous forme d’image 'time 60'.<ol>
<li>Pour obtenir l’image « temps 60 » du mélange après une incubation de 60 min, prenez un autre échantillon de 40 μL de chaque condition à partir de tubes rotatifs et pipette chaque échantillon sur une diapositive chargée. Image comme dans l’étape 2.2.2. REMARQUE : L’agrégation cellulaire doit être vérifiée toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la saturation se produise. Le moment de l’agrégation dépendra des protéines testées.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse ImageJ/Fidji
<ol><li>Pour quantifier l’étendue de l’agrégation à l’aide de Fiji/ImageJ, enregistrez les fichiers d’analyse.<ol>
<li>Enregistrez les fichiers de codage supplémentaires fournis dans le dossier macros imageJ sur l’ordinateur.</li>
		<li>Installez la macro agrégation fournie (Plugins, Macros, Installer et sélectionnez le fichier « AgrégationAssay.txt »).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminez les seuils.<ol>
<li>Chargez un fichier « time zero » .tif en imageJ et divisez les canaux(Image | Couleur | Canaux fractionnements). REMARQUE : L’image « temps zéro » est utilisée pour déterminer le seuil et la plus petite taille de ponction pour l’ensemble de l’expérience.</li>
		<li>Masquer chaque canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Faire masque de fenêtre d’image apparaîtra. Cochez les cases à côté de Déterminer le seuil d’image et déterminez les params de cluster à partir de l’histogramme et cliquez sur OK.</li>
		<li>Déterminez le seuil de l’image à l’aide de la barre de diapositives, enregistrez le numéro à droite de la barre de diapositives et cliquez sur OK.</li>
		<li>Un histogramme de taille de cluster apparaîtra. Sélectionnez une taille de cluster à partir de l’histogramme qui convient à l’expérience, tapez ce nombre dans la taille min cluster: boîte, et cliquez sur OK. Les grappes inférieures à cette taille ne seront pas analysées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez l’analyse.<ol>
<li>Ouvrez l’image « temps 60 » de l’état 1 dans l’imageJ et divisez les canaux comme à l’étape 3.2.1.</li>
		<li>Masquez chaque canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilisez le même seuil et la même taille déterminés à l’étape 3.2.3 et à l’étape 3.2.4. Désélectionner les cases à côté de déterminer le seuil d’image et déterminer les params de cluster à partir de l’histogramme et taper manuellement la taille et les seuils dans les champs appropriés, puis cliquez sur OK.</li>
		<li>Calculer l’indice d’agrégation(Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Sélectionnez les canaux masqués à comparer et l’annuaire dans lequel les fichiers résultants enregistreront.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.3.1-3.3.3 pour chaque image 'time 60' dans toutes les conditions. REMARQUE : L’indice d’agrégation est défini comme la zone de chevauchement totale divisée par la somme des deux zones de canal moins la zone de chevauchement multipliée par 100 (indice d’agrégation = zone de chevauchement/[zone du canal 1 + zone du canal 2 – zone de chevauchement] x 100). Cette normalisation est une opération « OR » entre les deux canaux masqués représentant le total des pixels dans l’un ou l’autre masque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Disséquer les interactions protéine-protéine qui se produisent en trans pendant l’adhérence cellulaire peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus cellulaires de base, y compris la formation, la fonction et le maintien des synapses pendant la maturation et le remodelage. Les implications des interactions cellule à cellule s’élargissent au-delà de la neurobiologie et jouent un rôle plus large dans la transduction du signal, la migration cellulaire et le développement<...

Les interactions synaptiques facilitées par les molécules d’adhérence synaptique sont fondamentales pour le développement, l’organisation, la spécification, la maintenance et la fonction des synapses et la génération de réseaux neuronaux. L’identification de ces molécules transsynaptiques d’adhérence de cellules augmente rapidement ; il est donc fondamentalement important d’identifier des partenaires contraignants et de comprendre comment ces nouvelles molécules d’adhérence interagissent les unes avec les autres. En outre, le séquençage du génome a identifié des mutations dans beaucoup de ces molécules d’adhérence qui sont généralement liées à une multitude de troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie1. Les mutations dans les gènes qui codent pour les molécules synaptiques d’adhérence cellulaire peuvent modifier négativement les interactions trans et peuvent contribuer à des altérations pathophysiologiques de la formation et ou de l’entretien de la synapse.
Il existe de multiples analyses pour évaluer quantitativement les interactions protéine-protéine telles que la calorimétrie isotherme, le dichroism circulaire, la résonance plasmonique de surface2 et bien que quantitatives, elles ont plusieurs limites. Tout d’abord, ils nécessitent des protéines recombinantes, exigeant parfois des étapes de purification longues et fastidieuses. Deuxièmement, ils nécessitent un équipement spécialisé sophistiqué et une expertise technique. Troisièmement, ils peuvent surestimer l’étendue de la liaison car ils permettent à la fois cis et interactions trans entre les protéines qui sont naturellement attachés à une membrane in vivo. Ici, nous proposons un test simple et relativement rapide qui teste exclusivement les interactions trans.
Pour contourner bon nombre des complications associées aux analyses de protéines purifiées, nous avons optimisé un test d’interaction protéique à base de cellules qui récapitule les interactions trans dans un système cellulaire héterologique réduit. Cet essai a été précédemment utilisé sous diverses formes pour étudier les interactions transcellulaires. Dans cette approche, les molécules d’adhérence des cellules candidats sont transfectées en cellules HEK293T. Dans des conditions physiologiques, les cellules HEK293T ne présentent pas d’auto-agrégation, ce qui en fait des modèles exemplaires pour cet essai. Cependant, lorsque des populations individuelles de cellules HEK exprimant des récepteurs et des ligands sont combinées, la liaison du récepteur et la ligand force l’agrégation des cellules HEK à se produire. Cette agrégation est médiée exclusivement par des interactions trans et est généralement observable en dizaines de minutes. Aucune étape de purification des protéines n’est requise dans cette méthode, et l’efficacité de la méthode repose sur le paradigme selon laquelle les populations de cellules HEK exprimant des molécules d’adhérence cognate sont combinées, puis photographiées seulement des dizaines de minutes plus tard. En outre, cette méthode est relativement peu coûteuse, car ni anticorps ni équipement coûteux ne sont nécessaires. Le seul équipement nécessaire à l’acquisition de données est un microscope fluorescent standard. Un avantage supplémentaire à cet essai basé sur la cellule est la capacité de dépister rapidement l’effet des mutations de point pertinentes de la maladie sur les interactions trans. Ceci peut être exécuté en transfectant des cellules de HEK avec des CDNAs des variantes mutantes de la protéine d’intérêt.
Dans ce protocole, nous présentons un exemple dans lequel nous étudions si une mutation de missense dans Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identifiée dans un patient diagnostiqué avec la déficience intellectuelle profonde et l’épilepsie, modifie des interactions dans trans avec la protéine transmembrane répétée riche en leucine 2 (LRRTM2). Neurexin3α est un membre de la famille evolutionarily conservé des molécules présynaptiques d’adhérence cellulaire et tandis que les travaux récents ont identifié de multiples rôles à la synapse3,4,5,6,7, notre compréhension synaptique de cette molécule et tous les membres de la famille neurexin reste incomplète. LRRTM2 est une protéine excitatrice d’adhérence cellulaire postsynaptique qui participe à la formation et à l’entretien de la synapse8,9,10. Fait important, LRRTM2 interagit exclusivement avec les isoformes de neurexine qui n’ont pas le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4-) mais pas avec les isoformes de neurexin contenant le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4+). La mutation de missense humaine (A687T) identifiée dans Neurexin3α est située dans une région extracellulaire non étudiée qui est evolutionarily conservée et est conservée entre tous les alpha neurexins7. Comme l’interaction entre ces deux molécules a étéétablie 8,9,11, nous avons posé la question: est la capacité contraignante de Neurexin3α SS4- à LRRTM2 modifié par une mutation point A687T? Cet essai a indiqué que la mutation de point d’A687T a augmenté de façon inattendue l’agrégation de Neurexin3α à LRRTM2 suggérant que la région extracellulaire dans laquelle la mutation ponctuelle est située, joue un rôle dans la médiation des interactions transsynaptiques.

<table><tbody><tr><td>Microtubes jetables de 1,5 mL avec bouchons à pression</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Incubation de population mixte de cellules HEK</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&mdash ; Unité de filtration à flux, membrane aPES de 0,2 μm</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Stérilisation des médias HEK</td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger SpectraTube</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Récolte de cellules HEK</td></tr><tr><td>6 plaques de culture de tissus bien stériles</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>Culture de cellules HEK</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Transfection de phosphate de calcium, remise en suspension de cellules HEK</td></tr><tr><td>Centrifugeuse- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Produits de laboratoire</td><td>75004377</td><td>Récolte de cellules</td></tr><tr><td>HEK Incubateur de</td> <td>cellules CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Incubation de cellules HEK pendant la croissance</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Modification de Dulbecco du milieu d’Eagle) avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td> Maintenance <td>des cellules</td></tr><tr><td>HEK Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passage/récolte Cellule HEK</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Récolte de cellules HEK</td></tr><tr><td>Falcon Fioles de culture ventilées, 75cm2 surface de croissance</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Élevage de cellules HEK</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>Entretien</td></tr> <tr>des cellules HEK<td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td></td><td>Système modèle</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V : 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Analyse d’images</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>Resuspension cellulaire HEK</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique anhydre</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Transfection de phosphate de calcium</td></tr><tr><td>Trypsine 0,25 % (1X) Solution</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passage de cellules HEK</td></tr><tr><td>Rotateur</td><td></td><td></td><td>de tube Incubation d’une population mixte de cellules HEK</td></tr><tr><td>Lames de microscope UltraClear. Blanc givré, chargé positivement</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Acquisition d’images</td></tr><tr><td>Microscope grand champ</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Acquisition d’images</td></tr></tbody></table>

mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Les interactions protéiques aux interfaces cellulaires dictent une multitude de résultats biologiques allant du développement tissulaire et de la progression du cancer à la formation et à l’entretien de la synapse. Bon nombre de ces interactions fondamentales se produisent en trans et sont généralement induites par des interactions hétérophiliques ou homophiliques entre les cellules exprimant des paires de liaisons ancrées dans la membrane. L’élucidation de la façon dont les mutations pertinentes à la maladie perturbent ces interactions protéiques fondamentales peut donner un aperçu d’une myriade de domaines de biologie cellulaire. De nombreux analyses d’interaction protéine-protéine ne se désambigulent généralement pas entre les interactions cis et trans, ce qui conduit potentiellement à une surestimation de l’étendue de la liaison qui se produit in vivo et impliquent la purification à forte intensité de main-d’œuvre des protéines et / ou de l’équipement de surveillance spécialisée. Ici, nous présentons un protocole simple optimisé qui permet l’observation et la quantification des interactions trans seulement sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipements spécialisés. L’analyse d’agrégation cellulaire HEK implique le mélange de deux populations indépendantes de cellules HEK, chacune exprimant des ligands cognate liés à la membrane. Après une courte période d’incubation, les échantillons sont photographiés et les agrégats qui en résultent sont quantifiés.

La mutation A687T augmente Neurexin3α SS4- liaison à LRRTM27 Pour étudier comment les interactions intercellulaires de deux protéines synaptiques connues sont affectées par l’introduction d’une mutation ponctuelle trouvée chez un patient souffrant de déficience intellectuelle et d’épilepsie, nous avons utilisé l’analyse d’agrégation cellulaire HEK ci-dessus (figure 1). Les cellules ont été transfectées selon l’article 1 et préparées pour l’imagerie selon les se...

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.

Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Le test cellulaire permet d’observer et de quantifier les interactions d’adhésion trans sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipement spécialisé. Bien que les interactions protéiques testées ici soient pertinentes pour la neurobiologie, cette méthode peut être appliquée à tout domaine de recherche où l’adhésion des protéines se produit de manière intercellulaire. 48 heures après la transfection des cellules HEK-293T, récoltez les cellules de la plaque à six puits pour les agréger.Tout d’abord, lavez bien chacun deux fois avec du PBS. Ensuite, pour dissocier doucement les cellules, ajoutez un millilitre de 10 millimolaires d’EDTA dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes d’incubation, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules et récoltez chaque puits dans un tube conique séparé de 15 millilitres.Centrifugez les tubes à 500 x g à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant que les cellules sont en granulation, préparez six tubes d’incubation en étiquetant le dessus des tubes de microcentrifugation avec les conditions expérimentales. Chaque permutation de GFP et de mCherry doit être utilisée.Retirez le surnageant des tubes coniques de 15 millilitres et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieu. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules dans chaque tube conique. Ensuite, aliquote 200 000 cellules de chaque condition dans le tube d’incubation approprié pour un mélange individuel dans un volume total de 500 microlitres.Après avoir évalué l’agrégation de base décrite dans la section suivante, placez les tubes d’incubation dans un rotateur de tube lent à température ambiante. Pour évaluer l’agrégation, au départ et à nouveau après 60 minutes, pipetez 40 microlitres du tube d’incubation sur une lame de microscope chargée. L’acquisition de la ligne de base doit être effectuée le plus rapidement possible après l’ajout des cellules dans le tube de microcentrifugation.Imagez la lame sous fluorescence dans les canaux vert et rouge. Pour chaque diapositive, capturez des images de trois champs de vision différents dans un plan focal. Les cellules HEK-293T ont été transfectées avec une protéine d’intérêt, une protéine mutée d’intérêt ou un ligand d’intérêt et co-transfectées avec une protéine fluorescente.Les populations cellulaires exprimant la protéine d’intérêt ont été mélangées avec des populations cellulaires exprimant le ligand d’intérêt et évaluées pour l’agrégation après 60 minutes. Dans les superpositions d’images capturées dans les canaux vert et rouge, l’agrégation apparaît sous forme de puncta jaune. Les conditions dans lesquelles les cellules n’exprimaient aucun ligand synaptique ont montré une agrégation minimale.De plus, une agrégation minimale a été observée lorsqu’une seule des deux populations exprimait des ligands synaptiques. Aucune agrégation n’a été mise en évidence lorsque les deux populations de cellules ont exprimé des molécules d’adhésion incompatibles. Les conditions avec des molécules d’adhésion compatibles ont montré une agrégation significative après une incubation de 60 minutes.Étonnamment, la protéine mutée d’intérêt a montré beaucoup plus d’agrégation que son homologue de type sauvage, ce qui suggère que la mutation ponctuelle améliore les capacités de liaison des protéines. Les mutations dans de nombreuses molécules d’adhésion sont généralement liées à des troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie. Avec cette technique, on peut dépister les effets des mutations ponctuelles pertinentes pour la maladie sur les interactions trans.

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Dans cette vidéo, nous démontrons un test d’agrégation de protéines basé sur des cellules utilisant des inhibiteurs de protéasome, qui bloquent l’activité du protéasome, empêchant les protéines mutantes mal repliées, fusionnées à un marqueur fluorescent, de subir une dégradation protéasomale dépendante de l’ubiquitine, conduisant à leur accumulation dans le cytoplasme cellulaire. Les agrégats de protéines sont ensuite visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence.

Essai de formation d’agrégats de protéines : méthode de détection et de quantification de l’agrégation de protéines dans des cellules cultivées lors de l’induction par un inhibiteur de protéasome

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Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

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Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

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Les protéines cognates du domaine J coopèrent avec le chaperon Hsp70 pour aider à une myriade de processus biologiques allant du pliage des protéines à la dégradation. Ici, nous décrivons un assay in situ de ligature de proximité, qui permet la surveillance de ces machineries de chaperon transitoirement formées dans les cellules bactériennes, de levure et humaines.

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Ici, une méthode est présentée pour l’analyse de la cinétique d’agrégation des protéines chez le nématode Caenorhabditis elegans. Les animaux d’une population synchronisée selon l’âge sont photographiés à différents moments, suivis d’un comptage semi-automatisé des inclusions dans CellProfiler et d’un ajustement à un modèle mathématique dans AmyloFit.

Surveillance de la cinétique d’agrégation des protéines in vivo à l’aide du comptage automatisé de l’inclusion chez Caenorhabditis elegans

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Mesure à molécule unique de la dynamique d’interaction des protéines dans les condensats biomoléculaires

Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour mesurer rapidement les interactions ligand-récepteur trans dans des cellules HEK-293T. Cette technique permet d'évaluer les effets des mutations sur l'adhésion protéique en neurobiologie.

Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

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