Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux
22 mai 2020
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.
Le test cellulaire permet d’observer et de quantifier les interactions d’adhésion trans sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipement spécialisé. Bien que les interactions protéiques testées ici soient pertinentes pour la neurobiologie, cette méthode peut être appliquée à tout domaine de recherche où l’adhésion des protéines se produit de manière intercellulaire. 48 heures après la transfection des cellules HEK-293T, récoltez les cellules de la plaque à six puits pour les agréger.
Tout d’abord, lavez bien chacun deux fois avec du PBS. Ensuite, pour dissocier doucement les cellules, ajoutez un millilitre de 10 millimolaires d’EDTA dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes d’incubation, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules et récoltez chaque puits dans un tube conique séparé de 15 millilitres.
Centrifugez les tubes à 500 x g à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant que les cellules sont en granulation, préparez six tubes d’incubation en étiquetant le dessus des tubes de microcentrifugation avec les conditions expérimentales. Chaque permutation de GFP et de mCherry doit être utilisée.
Retirez le surnageant des tubes coniques de 15 millilitres et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieu. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules dans chaque tube conique. Ensuite, aliquote 200 000 cellules de chaque condition dans le tube d’incubation approprié pour un mélange individuel dans un volume total de 500 microlitres.
Après avoir évalué l’agrégation de base décrite dans la section suivante, placez les tubes d’incubation dans un rotateur de tube lent à température ambiante. Pour évaluer l’agrégation, au départ et à nouveau après 60 minutes, pipetez 40 microlitres du tube d’incubation sur une lame de microscope chargée. L’acquisition de la ligne de base doit être effectuée le plus rapidement possible après l’ajout des cellules dans le tube de microcentrifugation.
Imagez la lame sous fluorescence dans les canaux vert et rouge. Pour chaque diapositive, capturez des images de trois champs de vision différents dans un plan focal. Les cellules HEK-293T ont été transfectées avec une protéine d’intérêt, une protéine mutée d’intérêt ou un ligand d’intérêt et co-transfectées avec une protéine fluorescente.
Les populations cellulaires exprimant la protéine d’intérêt ont été mélangées avec des populations cellulaires exprimant le ligand d’intérêt et évaluées pour l’agrégation après 60 minutes. Dans les superpositions d’images capturées dans les canaux vert et rouge, l’agrégation apparaît sous forme de puncta jaune. Les conditions dans lesquelles les cellules n’exprimaient aucun ligand synaptique ont montré une agrégation minimale.
De plus, une agrégation minimale a été observée lorsqu’une seule des deux populations exprimait des ligands synaptiques. Aucune agrégation n’a été mise en évidence lorsque les deux populations de cellules ont exprimé des molécules d’adhésion incompatibles. Les conditions avec des molécules d’adhésion compatibles ont montré une agrégation significative après une incubation de 60 minutes.
Étonnamment, la protéine mutée d’intérêt a montré beaucoup plus d’agrégation que son homologue de type sauvage, ce qui suggère que la mutation ponctuelle améliore les capacités de liaison des protéines. Les mutations dans de nombreuses molécules d’adhésion sont généralement liées à des troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie. Avec cette technique, on peut dépister les effets des mutations ponctuelles pertinentes pour la maladie sur les interactions trans
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Aperçu
Cette étude présente un protocole optimisé pour mesurer rapidement et de manière semi-quantitative les interactions ligand-récepteur en trans, en utilisant une approche de microscopie à fluorescence dans des cellules HEK-293T. La méthode permet la quantification des interactions d'adhérence protéique pertinentes pour la neurobiologie et potentiellement d'autres domaines de recherche.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurobiologie
- Adhésion cellulaire
- Interactions protéiques
Contexte
- Les interactions ligand-récepteur sont cruciales pour la communication cellulaire.
- Comprendre ces interactions aide à élucider les mécanismes des troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques.
- Les méthodes traditionnelles peuvent nécessiter une purification protéique extensive ou un équipement spécialisé.
- Cette étude propose une approche plus efficace utilisant la microscopie à fluorescence.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole rapide et efficace pour étudier l'adhérence protéique dans un test basé sur les cellules.
- Évaluer comment les mutations ponctuelles dans les protéines influencent les interactions en trans.
- Appliquer cette méthode de manière étendue dans les études d'adhérence protéique en dehors de la neurobiologie.
Méthodes utilisées
- La microscopie à fluorescence a été employée pour l'imagerie des interactions cellulaires.
- Les cellules HEK-293T ont été utilisées comme modèle biologique, en se concentrant sur les protéines transfectées et les ligands.
- Le calendrier expérimental impliquait une évaluation de l'agrégation cellulaire après 60 minutes post-transfection.
- Le dénombrement des cellules a été effectué à l'aide d'un hémocytomètre, suivi d'une resuspension et d'un mélange des cellules pour l'imagerie.
Résultats principaux
- L'agrégation des cellules exprimant des molécules d'adhérence compatibles a été significativement améliorée après 60 minutes.
- Les protéines mutées ont montré une agrégation plus importante comparée aux homologues de type sauvage, indiquant des capacités de liaison améliorées.
- Une agrégation minimale a été observée lorsque ni aucune ou seulement une population exprimait des ligands synaptiques.
Conclusions
- Cette étude démontre une méthode simplifiée pour évaluer les interactions adhésives intercellulaires.
- Les résultats soulignent le potentiel de cette technique pour explorer les effets des mutations sur les interactions protéiques.
- Les perspectives de cette méthode sont précieuses pour comprendre les mécanismes sous-jacents à divers troubles neurodéveloppementaux et psychologiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
