Name: Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez la co-expression de protéines marquées différemment dans Escherichia coli BL21(DE3) pour étudier les interactions protéine-protéine difficiles. Cette méthode permet un assemblage efficace des complexes et un dépistage rapide des conditions d'expression optimales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par les projets 19-74-30026 (développement et validation de méthodes) et 19-74-10099 (essais d’interaction protéine-protéine); et par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie-subvention 075-15-2019-1661 (analyse des interactions protéine-protéine représentatives).

La représentation schématique du flux de travail de la méthode est illustrée à la figure 1.
1. Co-transformation d’E. coli
<ol><li>Préparer des vecteurs d’expression pour les protéines cibles à l’aide de méthodes de clonage standard. REMARQUE: En règle générale, un bon point de départ consiste à utiliser des vecteurs pGEX/pMAL conventionnels portant un gène de résistance à l’ampicilline et une origine ColE1 pour l’expression de protéines marquées GST/MBP et un vecteur compatible d’origine p15A ou RSF et de résistance à la kanamycine pour exprimer des protéines marquées 6xHis, dans certains cas combinées avec de la thiorédoxine ou du SUMO-tag pour augmenter la solubilité. Habituellement, plusieurs combinaisons d’étiquettes doivent être testées avant l’expérience. La méthode décrite elle-même est pratique pour tester par lots les conditions d’expression des protéines cibles. Il est important de noter que la plupart des souches de Rosetta contiennent déjà le plasmide d’origine p15A pour exprimer les ARNt pour les codons rares; donc si l’utilisation de telles souches est une option possible, les plasmides p15A doivent être évités. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.<ol><li>Cultiver des bactéries d’une souche appropriée dans un milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C jusqu’à une densité optique (DO) de 0,1 à 0,2. La souche BL21(DE3) a été utilisée à titre d’exemple dans cette étude. NOTE: Il est recommandé d’utiliser des cellules compétentes fraîchement préparées pour obtenir une co-transformation efficace avec deux vecteurs. Si plus de deux vecteurs doivent être co-transformés, il est préférable de les transformer séquentiellement pour obtenir une bonne efficacité de transformation. L’électroporation est une bonne alternative.</li>
		<li>Centrifuger 1,0 mL de la suspension bactérienne pendant 1 min à 9 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de tampon de transformation (TB) glacé (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 et 15 mM CaCl2) et incuber pendant 10 min sur glace.</li>
		<li>Centrifuger pendant 30 s à 8 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de tampon TB, ajouter 100 ng de chaque vecteur et incuber pendant 30 minutes sur de la glace. Transformez séparément des vecteurs uniques pour étudier le comportement des protéines sans co-expression. En outre, co-transformez les vecteurs d’expression par paires avec des vecteurs de co-expression vides pour les contrôles de liaison non spécifiques. NOTE: Dans les exemples fournis dans cette étude, des vecteurs pGEX/pMAL avec des ADNc correspondants fusionnés à des ADNc GST/MBP ont été utilisés en combinaison avec des vecteurs compatibles dérivés de pACYC portant des domaines protéiques partenaires codant pour l’ADNc codant pour l’ADNc fusionné à l’ADNc de thiorédoxine.</li>
		<li>Chauffer à 42 °C pendant 150 s, puis refroidir pendant 1 min sur glace.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de milieu LB liquide sans antibiotiques et incuber à 37 °C pendant 90 min. Plaque sur des plaques de LB-agar contenant 0,5 % de glucose et les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont les suivantes : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expression
<ol><li>Rincer les cellules de la plaque avec 2 mL de milieu LB liquide dans 50 mL de milieu LB avec les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Ajouter des ions métalliques ou d’autres cofacteurs connus (dans les exemples fournis dans cette étude, 0,2 mM ZnCl2 a été ajouté au milieu). Conservez une partie aliquote contenant 20 % de glycérol à -70 °C pour une répétition ultérieure de l’expérience. REMARQUE: Il est recommandé de rincer plusieurs colonies directement de la plaque pour exclure la possibilité d’une mauvaise expression dans un seul clone isolé en raison d’événements de recombinaison occasionnels entre deux plasmides.</li>
	<li>Faire pousser les cellules avec une rotation constante de 220 tr/min à 37 °C jusqu’à une DO de 0,5 à 0,7, refroidir à température ambiante (RT) et ajouter l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 mM. Conserver une partie aliquote de 20 μL de suspension cellulaire comme témoin de l’échantillon non induit.</li>
	<li>Incuber les cellules avec une rotation constante de 220 rpm à 18 °C pendant la nuit. REMARQUE: Le temps et la température optimaux d’incubation peuvent varier; 18 ° C pendant la nuit fonctionne mieux pour la plupart des protéines et il est conseillé d’être essayé par défaut. Réduire le temps d’incubation à 2-3 h si une forte liaison non spécifique est observée.</li>
	<li>Divisez la suspension bactérienne en deux parties (ou plus si plus de deux étiquettes différentes ont été utilisées) et conservez une partie aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire pour confirmer l’expression de la protéine. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min. REMARQUE: Point de pause: les granulés bactériens peuvent être conservés à -70 ° C pendant au moins 6 mois.</li>
</ol>3. Essai de pulldown
REMARQUE: Les procédures détaillées sont décrites pour les protéines marquées avec 6xHis ou MBP / GST. Toutes les procédures sont effectuées à 4°C.
<ol><li>Remettez en suspension les pastilles bactériennes dans 1 mL de tampon de lyse glacé avec des inhibiteurs de protéase et des agents réducteurs (voir ci-dessous) ajoutés immédiatement avant l’expérience. Évitez le dithiotreitol (DTT) lorsque vous utilisez des résines chélatantes des métaux, car il élimine les ions métalliques. Ajustez la composition tampon pour les protéines testées. Les recettes courantes de tampons de lyse qui conviennent à la plupart des protéines sont:<ol><li>6xHis-pulldown : Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0,1 % NP40, 10 % [p/p] glycérol, 5 mM bêta-mercaptoéthanol, 1 mM de phénylméthylsfulfonylfluorure (PMSF) et une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF et une dilution 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Perturber les cellules par sonication sur glace. Conservez une partie aliquote de 20 μl pour l’électrophorèse. REMARQUE: En règle générale, 20-25 impulsions de 5 s avec des intervalles de 15 s avec une puissance de sortie de 20 W sont nécessaires par échantillon. Le pouvoir de sonication approprié doit être ajusté pour chaque instrument afin d’éviter la surchauffe et d’assurer une perturbation totale des cellules. Pour obtenir de meilleures performances, il est fortement recommandé d’utiliser des sondes sonicatrices multi-pointes à haut débit.</li>
	<li>Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min. Prélever 20 μL du lysat clarifié pour une analyse ultérieure SDS-PAGE.</li>
	<li>Équilibrer la résine (50 μL pour chaque échantillon) avec 1 mL de tampon de lyse glacée pendant 10 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.</li>
	<li>Ajouter des lysats cellulaires (concentration totale en protéines : 20-50 mg/mL) à la résine, incuber pendant 10 min à une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Prélever 20 μL de la fraction non liée pour l’analyse SDS-PAGE ultérieure.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé et incuber pendant 1 min. Centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Les recettes courantes pour les tampons de lavage sont:<ol><li>6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazole, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.</li>
		<li>GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer deux longs lavages : ajouter 1 mL de tampon de lavage à froid glacé, incuber pendant 10 à 30 min avec une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé, incuber pendant 1 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.</li>
	<li>Éluer les protéines liées avec 50 μL de tampon d’élution dans un agitateur à 1 200 tr/min pendant 10 min. Les recettes courantes de tampons d’élution sont:<ol><li>6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazole et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM de glutathion (ajusté à pH 7,5 avec Tris basique) et 5 mM de TNT.</li>
		<li>MBP-pulldown : Mélanger 20 mM de Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM de NaCl, 40 mM de maltose et 5 mM de TNT.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysez les protéines éluées avec SDS-PAGE. NOTE: Le pourcentage d’acrylamide doit être ajusté à la taille des protéines. Dans les exemples fournis dans cette étude, des gels d’acrylamide à 12 % ont été utilisés, fonctionnant dans un tampon tris-glycine-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1 % SDS) à tension constante de 180 V. Les gels ont été colorés par ébullition dans 0,2% de bleu de Coomassie R250, 10% d’acide acétique et 30% d’isopropanol, et décolorés par ébullition dans 10% d’acide acétique. La quantité de protéines chargées ne devrait pas être égale, car différentes quantités de protéines en interaction peuvent être tirées vers le bas dans différentes expériences.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
<li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number%3A+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li>
<li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li>
<li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70(2019).</li>
<li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+two-hybrid+%28F2H%29+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li>
<li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68(2008).</li>
<li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Doklady+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li>
<li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+insulator+proteins%2C+Pita+and+ZIPIC%2C+target+CP190+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li>
<li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16(2021).</li>
<li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La méthode décrite permet de tester les interactions protéine-protéine qui ne peuvent pas être assemblées efficacement in vitro et nécessitent une co-expression. La méthode est l’une des rares approches appropriées pour étudier les protéines hétérodimérantes, qui sont également capables d’homodimérisation puisque, lorsqu’elles sont purifiées séparément, ces protéines forment des homodimères stables qui ne peuvent le plus souvent pas se dissocier et se réassocier au cours de l’expérience <...

Le pulldown conventionnel est largement utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine1. Cependant, les protéines purifiées n’interagissent souvent pas efficacement in vitro2,3, et certaines d’entre elles sont insolubles sans leur partenaire de liaison 4,5. De telles protéines peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel ou la présence de chaperons moléculaires 5,6,7,8,9. Une autre limitation du pulldown conventionnel est le test d’une activité d’hétéromultimérisation possible entre des domaines qui peuvent exister sous forme d’homo-oligomères stables assemblés co-translationnellement 8,10, car beaucoup d’entre eux ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro pendant le temps d’incubation. La co-expression s’est avérée utile pour surmonter ces problèmes 3,11. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles chez les bactéries a été utilisée avec succès pour purifier de grands complexes macromoléculaires multi-sous-unités, y compris le complexe répressif polycomb PRC212, le module de tête de médiateur de l’ARN polymérase II13, la plaque de base du bactériophage T414, le module de déubiquitinylase du complexe SAGA 15,16 et la ferritine17. Les origines de réplication couramment utilisées pour la co-expression sont ColE1, p15A18, CloDF1319 et RSF20. Dans le système d’expression Duet disponible dans le commerce, ces origines sont combinées avec différents gènes de résistance aux antibiotiques et plusieurs sites de clonage pratiques pour produire des vecteurs polycistroniques, permettant l’expression de jusqu’à huit protéines. Ces origines ont des numéros de copie différents et peuvent être utilisées dans différentes combinaisons pour atteindre des niveaux d’expression équilibrés des protéines cibles21. Pour tester les interactions protéine-protéine, diverses étiquettes d’affinité sont utilisées; les plus courantes sont la 6xHistidine, la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine de liaison au maltose (MBP), chacune ayant une affinité spécifique avec la résine correspondante. La GST et le MBP améliorent également la solubilité et la stabilité des protéines marquées22.
Un certain nombre de méthodes impliquant la co-expression des protéines dans les cellules eucaryotes ont également été développées, dont la plus importante est le test à deux hybrides de levure (Y2H)23. Le test Y2H est bon marché, facile et permet de tester de multiples interactions; Cependant, son flux de travail prend plus de 1 semaine à compléter. Il existe également quelques essais à base de cellules de mammifères moins fréquemment utilisés, par exemple, le test fluorescent à deux hybrides (F2H)24 et le test d’interaction protéine-protéine (CAPPIA)25. Le test F2H est relativement rapide, permettant d’observer les interactions protéiques dans leur environnement cellulaire natif, mais implique l’utilisation d’équipements d’imagerie coûteux. Toutes ces méthodes ont un avantage sur l’expression procaryote fournissant la traduction eucaryote native et l’environnement de repliement; Cependant, ils détectent l’interaction indirectement, soit par activation transcriptionnelle, soit par transfert d’énergie fluorescente, ce qui produit souvent des artefacts. En outre, les cellules eucaryotes peuvent contenir d’autres partenaires d’interaction de protéines d’intérêt, ce qui peut interférer avec le test des interactions binaires entre les protéines des eucaryotes supérieurs.
La présente étude décrit une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement suivie de techniques conventionnelles de pulldown. La méthode permet d’étudier les interactions entre les protéines cibles qui nécessitent une co-expression. Il est plus rapide que le pulldown traditionnel, permettant de tester par lots plusieurs cibles, ce qui le rend avantageux dans la plupart des cas. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles est plus pratique que la co-expression polycistronique car elle ne nécessite pas d’étape de clonage laborieuse.

<table><tbody><tr><td>Sonde à 8 éléments</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>Sondes sonicatrices à 8 éléments à haut débit</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Résine amylose</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Résine pour la purification des protéines marquées MBP</td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamycine) ; A0839 (ampicilline)</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp ;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion agarose</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Résine pour la purification des protéines marquées GST</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Résine pour la purification de protéines 6xHis-marquées</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Vecteur de co-expression de protéines avec origine de réplication p15A</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Vecteur de co-expression de protéines avec l’origine de réplication de CloDF13</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Cocktail VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Cocktail pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Vecteur de co-expression de protéines avec origine de réplication RSF</td></tr><tr><td>SDS&nbsp ;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 Sonicateur</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>Processeur de liquide à ultrasons</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown est un test d’interaction protéine-protéine facile et largement utilisé. Cependant, il a des limites dans l’étude des complexes protéiques qui ne s’assemblent pas efficacement in vitro. De tels complexes peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel et la présence de chaperons moléculaires; Soit ils forment des oligomères stables qui ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro , soit ils sont instables sans partenaire liant. Pour surmonter ces problèmes, il est possible d’utiliser une méthode basée sur la co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement en utilisant un ensemble de vecteurs compatibles suivi des techniques conventionnelles de pulldown. Le flux de travail est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée en raison d’un nombre significativement plus petit d’étapes et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines qui existent dans l’environnement in vitro sont exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier un certain nombre d’interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées. La méthode peut être utilisée pour tester par lots les interactions protéine-protéine. Des résultats représentatifs sont présentés pour les études des interactions entre le domaine BTB et les protéines intrinsèquement désordonnées, et des hétérodimères des domaines associés aux doigts de zinc.

La méthode décrite a été utilisée couramment avec de nombreuses cibles différentes. Voici quelques résultats représentatifs qui ne peuvent probablement pas être obtenus en utilisant des techniques conventionnelles de pulldown. La première est l’étude de la dimérisation spécifique ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Les ZAD forment des dimères stables et spécifiques, les hétérodimères n’étant possibles qu’entre des domaines étroitement liés au sein de groupes paralogues. Les dimères formés par c...

Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.

Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Cette méthode permet d’étudier les formations de complexes protéiques qui nécessitent une co-expression pour des échantillons de test efficaces, tels que la formation d’hétérodimères. Le principal potentiel final de cette méthode est d’exploiter la co-expression de protéines étudiées marquées différentiellement en utilisant des combinaisons de vecteurs compatibles pour promouvoir un assemblage complexe efficace, ainsi qu’un flux de travail et une évolutivité rapides permettant des tests patch rapides de multiples interactions. Cette méthode peut également être utilisée pour le dépistage rapide des conditions optimales d’expression et de purification des protéines.La démonstration visuelle permet d’effectuer correctement les étapes critiques du protocole, telles que la configuration de la co-expression, la perturbation des cellules et les étapes de retrait ultérieures. Pour commencer, cultivez la souche Escherichia coli BL21(DE3) dans un milieu Luria-Bertani, ou LB, à 37 degrés Celsius jusqu’à une densité optique, ou OD, de 0,1 à 0,2. Centrifuger un millilitre de suspension bactérienne pendant une minute à 9 000 G à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de transformation glacé, ou TB, et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. À la fin de l’incubation, centrifuger pendant 30 secondes à 8 000 g à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon TB, 100 nanogrammes de chaque vecteur et incuber pendant 30 minutes sur de la glace.Chauffer à 42 degrés Celsius pendant 150 secondes, puis refroidir sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajoutez un millilitre de média LB sans antibiotiques et incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après incubation, centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de milieu LB avant de plaquer la suspension sur une plaque de gélose LB contenant 0,5% de glucose et les antibiotiques correspondants.Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincer les cellules de la plaque avec deux millilitres de média LB dans 50 millilitres de média LB avec les antibiotiques correspondants. Ajoutez des ions métalliques ou d’autres cofacteurs connus avant de stocker une partie aliquote contenant du glycérol à 20 % à moins 70 degrés Celsius pour des expériences ultérieures.Cultiver les cellules avec une rotation constante de 220 RPM à 37 degrés Celsius à une OD de 0,5 à 0,7. Refroidir la culture à température ambiante et ajouter IPTG à une concentration finale d’un millimole. Conserver une partie aliquote de 20 microlitres de suspension cellulaire comme témoin de l’échantillon non induit.Incuber les cellules pendant la nuit à 220 RPM à 18 degrés Celsius. Le lendemain, divisez la suspension bactérienne en deux parties et stockez des aliquotes de 20 microlitres pour confirmer l’expression des protéines. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 4 000 G pendant 15 minutes.Pour le test pulldown, remettre les granulés en suspension dans un millilitre de tampon de lyse glacée avec des inhibiteurs de protéase et des agents réducteurs ajoutés immédiatement avant l’expérience. Ajustez la composition tampon pour les protéines testées. Perturbez les cellules par sonication sur de la glace et stockez une partie aliquote de 20 microlitres pour l’électrophorèse.Centrifuger à 16 000 G pendant 30 minutes et recueillir 20 microlitres du lysat clarifié pour l’électrophorèse. Équilibrer la résine avec un millilitre de tampon de lyse glacée pendant 10 minutes, puis centrifuger à 2 000 G pendant 30 secondes et jeter le surnageant. Ajouter des lysats cellulaires à la résine et incuber pendant 10 minutes à une rotation constante de 15 RPM.Ensuite, centrifuger et jeter le surnageant avant de recueillir 20 microlitres de la fraction non liée pour analyse. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage glacé et incuber pendant une minute. Encore une fois, centrifugez et jetez le surnageant.Ensuite, effectuez deux longs lavages avec un tampon de lavage glacé. Après le deuxième lavage, éluer les protéines liées avec 50 microlitres de tampon d’élution dans un agitateur à 1 200 tr / min à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Analyser les protéines éluées avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS.Des études sur le domaine associé aux doigts de zinc, ou ZAD, l’homo-dimérisation dans la protéine de liaison au maltose, ou MBP, et les tests 6xHistidine pulldown sont présentées ici. La co-expression des ZAD fusionnés MBP et Thiorédoxine 6xHistidine montre une activité d’homodimérisation bonne et reproductible, apparaissant comme une bande supplémentaire dans les résultats SDS-PAGE du test de pulldown MBP. Un autre exemple d’utilisation de la méthode pour étudier la formation complexe alternative est montré ici.Dans le test de co-expression, ENY2 marqué 6xHistidine a interagi à la fois avec Sgf11 marqué GST et MBP-CTCF, mais aucun GST-Sgf11 n’était présent dans les pulldowns MBP et vice-versa. Une comparaison étape par étape des intervalles de temps requis dans le flux de travail du test pulldown conventionnel par rapport au pulldown couplé à la co-expression est présentée ici. Les résultats de l’utilisation des deux techniques pour étudier la même interaction entre le domaine BTB de la protéine CP190 et le domaine C-terminal marqué GST de la protéine CTCF de la drosophile sont présentés ici.Le choix correct du test d’affinité et de solubilité, Thiorédoxine, GST ou MBP, est essentiel pour l’exécution efficace du test. Une autre étape critique est la perturbation rapide et uniforme des cellules. Il est fortement recommandé d’utiliser des sondes sonicatrices multi-pointes.Cette méthode permet l’étude directe de la formation d’hétérodimères entre des domaines protéiques qui forment autrement des homodimères qui ne se dissocieraient pas lors de l’incubation de protéines purifiées dans le test de pulldown conventionnel.

pulldown-assay-coupled-with-co-expression-bacteria-cells-as-time

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Test interaction protéine-protéine est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité des protéines. Ici, nous introduisons...

Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l&#39;interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro</em

Dans cette vidéo, nous démontrons le test homogène de proximité luminescent amplifié, un test de proximité basé sur des billes. Il utilise des billes accepteuses et donneuses de taille homogène, immobilisées avec deux protéines qui ont tendance à interagir pour cribler les petites molécules potentielles inhibant les interactions protéiques.

Amplified luminescent Proximity Homogeneous Assay : Un test de proximité basé sur des billes pour cribler de petites molécules inhibant les interactions protéine-protéine

Cette vidéo présente la purification par affinité en tandem, une technique permettant de purifier les complexes protéiques des cellules eucaryotes afin d’étudier l’interaction protéine-protéine. Le complexe contient deux protéines marquées avec des étiquettes d’épitopes différentes. Lors de la purification du complexe à l’aide de deux résines ayant une affinité pour les deux marqueurs différents de manière séquentielle, la présence des deux protéines dans l’élué confirme l’interaction entre les...

Essai de purification d’affinité en tandem pour étudier les interactions protéine-protéine

Cet article illustre l’utilisation du marquage radio par chasse d’impulsions en combinaison avec la photoréticulation spécifique au site pour surveiller les interactions entre une protéine d’intérêt et d’autres facteurs chez E. coli. Contrairement aux méthodes traditionnelles de réticulation chimique, cette approche génère des « instantanés » à haute résolution d’une voie d’assemblage ordonnée dans une cellule vivante.

Surveillance de l’assemblage d’un facteur de virulence bactérienne sécrété à l’aide d’une réticulation spécifique au site

Les interactions entre protéines sont essentielles à tous les processus cellulaires. Utilisation Bioluminescence Resonance Energy Transfer, l'interaction entre une paire de protéines peut être surveillée dans des cellules vivantes et en temps réel. En outre, les effets des mutations potentiellement pathogènes peuvent être évaluées.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Expériences d'immunoprécipitation SILAC représentent un puissant moyen de découvrir de nouvelles interactions protéine: protéine. En permettant la quantification relative exacte de l'abondance de la protéine à la fois le contrôle et les échantillons de test, les interactions véritables peut être facilement distinguée de contaminants expérimentales, et les interactions de faible affinité préservée grâce à l'utilisation de conditions de tampon moins rigoureuses.

Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

Les protéines interagissent entre elles et ces interactions déterminent en grande partie leurs fonctions. Les partenaires d’interaction protéique peuvent être identifiés à haut débit in vivo à l’aide d’un test de fitness chez la levure basé sur le test de complémentation de fragments de protéine dihydrofolate réductase (DHFR-PCA).

L&#39;échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

La co-expression des protéines est une alternative puissante à la reconstitution in vitro de complexes protéiques, et est d’une aide pour réaliser des tests biochimiques et génétiques in vivo. Ici, nous rapportons l’utilisation de la co-expression protéique chez Escherichia coli pour obtenir des complexes protéiques et pour ajuster la fréquence de mutation des cellules.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.

Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

Découvrez la co-expression de protéines marquées différemment dans Escherichia coli BL21(DE3) pour étudier les interactions protéine-protéine difficiles. Cette méthode permet un assemblage efficace des complexes et un dépistage rapide des conditions d'expression optimales.

Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles (Vidéo) | JoVE Journal

Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Explorer plus de vidéos