Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation de nanoparticules polymériques pour la surexpression de gènes thérapeutiques dans des cellules souches, à l'aide d'un modèle d'ischémie de membre postérieur marin. Cette approche est réalisée en premier lieu par la synthèse de polymères biodégradables via une réaction de mic édition en deux étapes, suivie de la fabrication de nanoparticules polymériques codant des gènes thérapeutiques. La deuxième étape consiste à transfecter in vitro des cellules souches adipeuses humaines afin de surexprimer le facteur de croissance endothélial vasculaire.

Ensuite, les cellules souches programmées sont injectées par voie intramusculaire dans un membre postérieur ischémique pour la production de facteurs thérapeutiques par NC deux. La dernière étape consiste à surveiller, au fil du temps, la survie cellulaire et la reperfusion sanguine dans le membre ischémique à l’aide d’une imagerie bioluminescente et d’une imagerie laser Doppler. Enfin, des analyses quantitatives de l’expression génique et des examens histologiques peuvent être réalisés afin de démontrer l’expression localisée des facteurs thérapeutiques et l’efficacité de la régénération tissulaire.

L'avantage de cette technique par rapport aux méthodes conventionnelles d'angiogenèse réside dans l'utilisation de cellules souches comme véhicules pour la délivrance de médicaments. Cette stratégie nous permet d'exploiter la capacité naturelle de migration des cellules souches vers les zones ischémiques, et autorise également des réponses dynamiques aux signaux de l'environnement microscopique. Les nanoparticules utilisées pour la délivrance de l'ADN plasmidique sont hautement efficaces et biodégradables, ce qui réduit la cytotoxicité et permet une livraison intracellulaire d'un plus grand nombre de copies d'ADN.

Cette technique peut être appliquée à de nombreux traitements thérapeutiques cellulaires cliniquement pertinents, car elle utilise un vecteur non viral biodégradable pour insérer des gènes dans des cellules autologues. Dans une hotte, peser le DLI de butane dial et transférer le matériau dans un flacon d'inhalation en verre contenant une barrette d'agitation. Ensuite, ajouter du cinq acide aminé un pentol préchauffé dans le même flacon. Placer immédiatement le flacon sur une plaque agitatrice et régler la vitesse à 600 tr/min.

Transférez le flacon dans un four réglé à 90 degrés Celsius et augmentez la vitesse d'agitation à 1000 tr/min après quatre heures, puis réduisez la vitesse à 300 tr/min et agitez pendant 12 à 16 heures supplémentaires. Lorsque c'est prêt, ajoutez 10 millilitres de tétrahydrofurane anhydre à cinq grammes de C 32 dans un flacon en verre contenant une barrette d'agitation. Après avoir enveloppé dans du papier aluminium, vortexez à puissance maximale jusqu'à dissolution complète dans un autre flacon en verre contenant une barrette d'agitation, puis ajoutez 10 millimolaires de tétraéthylèneglycol diamine.

Ajoutez 40 millilitres de THF dans ce flacon, placez les deux flacons sur un agitateur magnétique pendant cinq minutes avant de les combiner. Recouvrez le produit obtenu de papier d’aluminium et laissez-le reposer à température ambiante pendant 24 heures. Le produit final est appelé C 32 1 22.

Transférez ensuite 30 millilitres d'éther de dathyle anhydre dans chacun de cinq tubes Falcon de 50 millilitres. Après avoir ajouté le C 32 1 22 à l'éther de dyl anhydre, une solution blanche et trouble se forme ; vortexez le tube, puis centrifugez-le. Le polymère extrait s'accumulera à la base du tube ; éliminez la phase supérieure et répétez ces étapes deux fois supplémentaires.

Une fois extrait, placer les tubes ouverts dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit, en veillant à ce que les tubes soient protégés de la lumière. Le lendemain, peser les tubes contenant C 32 1 22 afin de déterminer la masse finale. Enfin, dissoudre le polymère extrait dans du DMSO anhydre à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Pour la préparation des nanoparticules. Diluez d'abord l'ADN plasmidique à une concentration finale de 120 microgrammes par millilitre dans de l'acétate de sodium. Dans un second tube, diluez le C 32 1 22 à une concentration finale de 3,6 milligrammes par millilitre dans de l'acétate de sodium. Mélangez ensuite le contenu de chaque tube dans un seul tube Falcon de 15 millilitres et vortexez immédiatement à vitesse élevée pendant 10 secondes.

Laisser le tube reposer à température ambiante pendant 10 minutes afin que la formation des nanoparticules ait lieu pendant que les nanoparticules se forment. Remplacer le milieu dans un flacon de culture tissulaire préalablement ensemencé par 7,8 millilitres de DMEM complètement supplémenté.

Transférez la solution de nanoparticules dans le flacon de culture tissulaire et répartissez-la uniformément avant de placer le flacon dans l’incubateur. Après deux heures, remplacez le milieu contenant les nanoparticules par du DMEM. Après quatre heures, les cellules sont prêtes à être injectées in vivo.

Lorsque les cellules transfectées sont prêtes, comptez-les et ajustez leur densité à 10 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre dans du PBS afin de garantir qu'aucune souris ne reçoive une quantité inégale. Répartissez les suspensions cellulaires dans des tubes Eppendorf en volumes de 110 microlitres. Ensuite, anesthésiez une souris ayant précédemment subi une ischémie des membres postérieurs.

Après avoir confirmé l'anesthésie par une pincée du orteil, nettoyez le site d'injection avec une seringue de 27 gauge. Remettez les cellules en suspension et aspirez 100 microlitres de la suspension. Injectez la moitié de la suspension cellulaire dans la région du muscle adducteur, puis injectez l'autre moitié dans la région du muscle du mollet.

Après l'injection, laissez la seringue en place pendant au moins 15 à 30 secondes afin d'éviter toute fuite. Une fois les injections terminées, maintenez l'animal au chaud jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé. Pour l'imagerie de bioluminescence, vérifiez l'anesthésie à l'aide d'une pincée du orteil, puis nettoyez le site d'injection comme indiqué précédemment.

Remplir une seringue à insuline avec 100 microlitres de Lucifer et l'injecter par voie intrapéritonéale. Avant de placer l'animal dans la chambre d'imagerie ivus Luciferase, acquérir une image des souris avec un temps d'exposition d'une minute. Une fois l'image obtenue, marquer la région d'intérêt.

Dans ce cas, le membre ischémique au site d'injection des cellules continue de mesurer le signal de la luciférase toutes les trois à cinq minutes jusqu'à ce que le signal atteigne un pic et commence à diminuer. Cette valeur est utilisée pour la comparaison entre les souris et à différents points temporels. Une fois l'opération terminée, retirer les souris de la chambre et maintenir l'animal au chaud jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli. Les tissus sont prélevés à des moments choisis.

Après la transfection et l'euthanasie, inciser la peau entourant le membre postérieur de manière circonférentielle au niveau de la région abdominale distale et au-dessus du membre postérieur. Après avoir tiré la peau vers l'arrière, amputer le membre entre l'articulation pelvienne et celle du fémur. Enfin, isoler les muscles adducteur médial et gastrocnémien.

Pour une analyse plus poussée, ces images illustrent la synthèse du C 32 1 22. Ici, le C 32 AC lié à l'ACR a été formé par une réaction de couplage entre un monomère portant des groupements terminaux DAL et un monomère possédant un groupement terminal primaire de type amine. Dans cet exemple, des polymères PBAE modifiés peuvent être obtenus en ajoutant des monomères terminés par une amine afin d'améliorer l'efficacité de transfection.

Une transfection réussie se manifeste par la surexpression de la protéine fluorescente verte, comme illustré ici. Ces données d'imagerie bioluminescente montrent une souris au jour zéro et au jour 14. Après injection de cellules souches mésenchymateuses provenant du tissu adipeux positives pour la GFP et la luciférase dans le membre postérieur, des images Doppler représentatives démontrent l'induction d'une ischémie d'un côté du membre postérieur jumeau au jour zéro, ainsi qu'une reperfusion sanguine réussie.

14 jours après l'injection de cellules souches adipeuses surexprimant le VEGF. La RT-PCR a confirmé la surexpression réussie de vgf, la protéine thérapeutique codée, dans le groupe traité quatre jours après l'injection des cellules, alors qu'aucune expression n'a été détectée dans le témoin PBS. D'autres méthodes combinant une approche de thérapie génique et d'administration de cellules souches peuvent être réalisées afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour favoriser la régénération tissulaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse de polymères biodégradables destinés à la thérapie génique non virale, ainsi que de l'utilisation de ces polymères pour programmer des cellules souches en vue du traitement de l'ischémie in vivo. L'utilisation de cellules souches modifiées non viralement afin d'exprimer de manière surexprimée des facteurs thérapeutiques in situ pourrait être largement utile pour traiter une grande variété de maladies dégénératives.