Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’utilisation de nanoparticules polymères pour la surexpression de gènes thérapeutiques dans les cellules souches à l’aide d’un modèle d’ischémie marine des membres postérieurs. Pour ce faire, on synthétise d’abord des polymères biodégradables par une réaction d’édition micro en deux étapes, suivie de la fabrication de nanoparticules polymères codant pour des gènes thérapeutiques. La deuxième étape consiste à transfecter in vitro des cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux en facteur de croissance endothélial vasculaire surexprimé.

Ensuite, des cellules souches programmées sont injectées par voie intramusculaire dans un membre postérieur ischémique pour la production de facteurs thérapeutiques NC deux. La dernière étape consiste à surveiller la survie cellulaire et la reperfusion sanguine dans le membre ischémique au fil du temps à l’aide de l’imagerie par bioluminescence et de l’imagerie laser Doppler. En fin de compte, l’expression quantitative des gènes et l’histologie peuvent être effectuées pour montrer l’expression localisée des facteurs thérapeutiques et l’efficacité de la régénération tissulaire.

L’avantage de cette technique par rapport aux méthodes conventionnelles d’angiogenèse est l’utilisation de cellules souches comme véhicules pour l’administration de médicaments. Cette stratégie nous permet d’utiliser la capacité naturelle de binage des cellules souches pour migrer vers l’ischémie, et permet également des réponses dynamiques aux signaux microenvironnementaux. Les nanoparticules utilisées pour l’administration de l’ADN plasmatique sont très efficaces et biodégradables, ce qui permet une cytotoxicité plus faible et un plus grand nombre de copies d’ADN délivrées par voie intracellulaire.

Cette technique peut être appliquée à de nombreuses thérapies cellulaires cliniquement pertinentes, car elle utilise un vecteur non viral biodégradable pour insérer des gènes dans des cellules autologues. Ensuite, ajoutez cinq amino un pentol préchauffés dans le même flacon. Placez immédiatement le flacon sur une plaque d’agitation et réglez la vitesse à 600 tr/min.

Transférez le flacon dans un four réglé à 90 degrés Celsius et augmentez la vitesse d’agitation à 1000 tr/min après quatre heures, baissez la vitesse à 300 tr/min et remuez pendant 12 à 16 heures supplémentaires. Lorsque vous êtes prêt, ajoutez 10 millilitres de tétra hydro uran anhydre à cinq grammes de C 32 dans un flacon en verre contenant un agitateur. Après avoir enveloppé dans une feuille d’aluminium à puissance élevée jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous dans un flacon en verre séparé contenant un agitateur, ajoutez 10 millimolaires de tétraéthylène glycol diamine.

Ajoutez 40 millilitres de THF dans ce flacon, placez les deux flacons sur une plaque à mélanger pendant cinq minutes avant de les combiner. Couvrez le résultant dans du papier d’aluminium et laissez-le fixer à température ambiante pendant 24 heures. Le produit final est appelé C 32 1 22.

Ensuite, transférez 30 millilitres d’éther dathylique anhydre dans chacun des cinq tubes de faucon de 50 millilitres. Après avoir ajouté du C 32 1 22 à de l’éther dylique anhydre, une solution trouble blanche forme un vortex dans le tube, puis le centrifuge. Le polymère extrait s’accumulera à la base du tube, jettera la solution supérieure et répétera ces étapes deux fois de plus.

Une fois extraits, placez les tubes ouverts dans le dessiccation et mettez l’aspirateur pendant la nuit, assurez-vous que les tubes sont à l’abri de la lumière. Le lendemain, pesez les tubes contenant C 32 1 22 pour déterminer la masse finale. Enfin, dissoudre le polymère extrait dans du DMSO anhydre à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Pour la préparation de nanoparticules. Diluez d’abord l’ADN plasmatique à une concentration finale de 120 microgrammes par millilitre dans de l’acétate de sodium dans un deuxième tube, diluez C 32 1 22 à une concentration finale de 3,6 milligrammes par millilitre. Dans l’acétate de sodium, combinez le contenu de chaque tube dans un seul tube Falcon de 15 millilitres et utilisez immédiatement à puissance élevée pendant 10 secondes.

Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 10 minutes pour que la formation de nanoparticules se produise pendant la formation des nanoparticules. Remplacer le milieu dans un flacon de culture tissulaire préalablement placé par 7,8 millilitres. DMEM entièrement supplémenté.

Transférez la solution de nanoparticules dans le flacon de culture tissulaire et étalez-la uniformément avant de la placer dans l’incubateur. Après deux heures, remplacez le milieu contenant des nanoparticules par du DMEM. Après quatre heures, les cellules sont prêtes pour l’injection in vivo.

Lorsque les cellules transfectées sont prêtes, comptez les cellules à une densité de 10 fois 10 des six cellules par millilitre dans le PBS pour vous assurer que chaque souris reçoit une quantité égale. Séparez les suspensions cellulaires en tubes einor à un volume de 110 microlitres. Ensuite, anesthésie une souris qui a déjà subi une ischémie des membres postérieurs.

Après avoir confirmé l’anesthésie par pincement des orteils, nettoyez le site d’injection avec une seringue de calibre 27. Remettre les cellules en suspension et aspirer 100 microlitres de suspension. Injectez la moitié de la suspension cellulaire dans la région du muscle adducteur, puis injectez l’autre moitié dans la région musculaire du mollet.

Après l’injection, laissez la seringue en place pendant au moins 15 à 30 secondes pour éviter les fuites. Lorsque les injections sont terminées, gardez l’animal au chaud jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Pour l’imagerie par bioluminescence, confirmez l’anesthésie avec un pincement des orteils, puis nettoyez le site d’injection comme indiqué précédemment.

Remplissez une seringue à insuline avec 100 microlitres de Lucifer et injectez-la par voie intrapéritonéale. Avant de placer l’animal dans la chambre d’imagerie ivus luciferase, imagez les souris avec un temps d’exposition d’une minute. Lorsque l’image est acquise, marquez la région d’intérêt.

Dans ce cas, le membre ischémique au site d’injection de la cellule continue de mesurer le signal de la luciférase toutes les trois à cinq minutes jusqu’à ce que le signal atteigne un pic et commence à décliner. Il s’agit de la valeur utilisée pour la comparaison entre les souris et au fil du temps, une fois terminé, retirez les souris de la chambre et gardez l’animal au chaud jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Les tissus sont récoltés à un moment choisi.

Points après transfection après euthanasie, coupez la peau entourant le membre postérieur circonférentiellement au niveau de la région abdominale distale et à proximité du membre postérieur. Après avoir tiré la peau vers l’arrière, amputez le membre entre l’articulation pelvienne et le fémur. Enfin, l’adducteur médial et les muscles gastrocaux sont isolés.

Pour une analyse plus approfondie, ces images représentent la synthèse de C 32 1 22. Ici, le C 32 AC terminé lié à l’ACR a été formé par une réaction d’édition micro entre un monomère avec des groupes terminaux DAL et un monomère avec un groupe final moyen am primaire. Dans cet exemple, des polymères PBAE modifiés peuvent être formés en ajoutant des monomères à terminaison moyenne pour une efficacité de transfection améliorée.

Une transfection réussie est apparente par la surexpression de la protéine fluorescente verte, comme on le voit ici. Ces données d’imagerie de bioluminescence montrent une souris au jour zéro et au jour 14. Après l’injection de cellules souches dérivées de la graisse adipeuse positive à la GFP luciférase dans le membre postérieur, des images Doppler représentatives démontrent l’induction d’une ischémie dans un côté du membre postérieur en miroir au jour zéro et une reperfusion sanguine réussie.

14 jours après l’injection de VEGF sur l’expression de cellules souches dérivées du tissu adipeux. R-T-P-C-R a confirmé le succès de la régulation positive de vgf, la protéine thérapeutique codée dans le groupe traité quatre jours après l’injection cellulaire, alors qu’aucune expression n’a été détectée dans le contrôle PBS. D’autres méthodes qui appliquent une approche combinée de cellules souches et d’administration de gènes peuvent être mises en œuvre afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour favoriser la régénération des tissus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des polymères biodégradables pour la thérapie génique non virale et d’utiliser ces polymères pour programmer des cellules souches pour le traitement de l’ischémie et vivo