Isolement et 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Présenté ici est un protocole pour l'isolement des hépatocytes de souris des foies adultes de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la culture à long terme des hépatocytes dans un arrangement 3D de sandwich de collagène aussi bien que l'immunolabeling des composants cytosquelettiques pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse au traitement.

Ce protocole facilite l’isolement et la culture reproductible à long terme des hépatocytes de souris dans un environnement sandwich au collagène 3D pour étudier la formation de la structure canonique et sa réponse au traitement in vitro. Une fois que la technique a été maîtrisée, c’est une méthode rapide pour obtenir de grands volumes de population d’hépatocytes de souris très viables et purs pour des études in vitro. Lenka Sarnova, technicienne de notre laboratoire, démontrera la procédure.

La veille de l’isolement primaire des hépatocytes, ajouter 100 microlitres de 10X DMEM, 485 microlitres d’eau distillée et 15 microlitres d’un hydroxyde de sodium molaire dans 500 microlitres au collagène à queue de rat. Vérifiez le pH du collagène neutralisé. Il devrait être d’environ 7,5.

À l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie de 200 microlitres, étendre 100 microlitres de la solution neutralisée de collagène sur chacun des plats de culture en plastique de 3,5 centimètres de diamètre sur la glace et placer les plats dans des conditions de culture standard pendant la nuit. Le lendemain matin, réhydrater les couches de collagène avec un millilitre de 37 degrés Celsius PBS par plat pendant au moins trois heures à 37 degrés Celsius. Pour isoler le foie, après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, placez la souris anesthésiée sur un tapis de dissection en position supine et collez les extrémités inférieure et supérieure au tapis.

Écouvillonner l’abdomen avec 70% d’éthanol et faire une incision en forme de V de la zone pubienne à chaque membre antérieur. Pliez la peau sur la poitrine pour découvrir la cavité abdominale et placez le tapis sous un microscope disséquant. Déplacez l’intestin grêle et le côlon dans la direction caudale pour exposer l’IVC et charger une seringue de deux millilitres avec 2,5 millilitres de solution Celsius de 37 degrés C.Connectez la seringue à la canule et utilisez un coton-tige trempé PBS pour presser le foie jusqu’au diaphragme.

Placez une suture trempée autour de l’IVC juste en dessous du foie. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline équipée d’une aiguille de calibre 30 pliée à un angle de 45 degrés, injectez 10 microlitres de 5000 unités par millilitre d’héparine dans la veine portail. Pour cannuler le foie, utilisez des ciseaux microchirurgiens pour faire une petite incision dans l’IVC directement à côté du foie et insérer la canule dans l’incision.

Fixez la canule en place avec des sutures et deux nœuds chirurgicaux et coupez la veine portail pour permettre aux tampons de perfusion de s’écouler du foie. Puis déprimez lentement le piston de seringue pour parcourir le foie avec deux millilitres de la solution sur une période d’environ 15 secondes. Lorsque toute la solution a été livrée, pré-remplir une pompe périssaliste avec une solution C fraîche de 37 degrés Celsius et vérifier l’appareil de perfusion pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le système.

Déconnectez soigneusement la canule de la seringue et connectez rapidement mais soigneusement le tube de la pompe périsaltique en marche à la canule. Démarrez immédiatement la perfusion à un débit de 2,5 millilitres par minute. Après deux minutes, passez à la solution D et continuez la perfusion pendant 10 minutes supplémentaires.

À la fin de la perfusion, récoltez soigneusement le foie dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de solution De 37 degrés Celsius E.To isolez les hépatocytes primaires, tenant le foie par la canule, frottez le tissu autour de la paroi du tube pour frapper les hépatocytes dans le tampon. Lorsque tout le tissu a été écrasé, transférer le lisier tissulaire dans une passoire en nylon pore de 70 micromètres pour filtrer les cellules isolées dans un nouveau tube de 50 millilitres. Sédimenter les cellules hépatiques par centrifugation et réutiliser la pastille en 20 millilitres de 40% Percoll dans DMEM.

Séparez les cellules vivantes et mortes par centrifugation et réutilisez la pastille en 20 millilitres de solution E.Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, réutilisez la pastille en 10 millilitres de solution fraîche E pour le comptage. Après comptage, ajuster le nombre primaire d’hépatocytes à 3,75 fois 10 aux cinq cellules viables par millilitre de milieu de culture des hépatocytes. Pour la culture des hépatocytes primaires isolés dans les sandwichs au collagène 3D, utilisez une pipette d’un millilitre pour répartir uniformément deux millilitres de cellules sur chaque plat de 3,5 centimètres de diamètre enduit de collagène.

Placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Pendant l’incubation, préparer 100 microlitres de collagène neutralisé queue de rat une solution par plat comme démontré. À la fin de l’incubation, remplacez soigneusement les cellules moyennes et non attachées par 100 microlitres de collagène neutralisé par plat et retournez les assiettes à l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure.

Lorsque le collagène s’est solidifié, ajouter soigneusement deux millilitres de culture d’hépatocytes frais à chaque plat et retourner les cultures à l’incubateur pendant trois à huit jours en vérifiant les cultures quotidiennement au microscope. Pour l’immunolabeling des hépatocytes primaires dans les sandwichs de collagène 3D, lavez chaque sandwich soigneusement avec 37 degrés Celsius PBS et fixez les cultures avec un millilitre de 4% de paraformaldéhyde dans PBS par plat pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, laver la vaisselle trois fois pendant 10 minutes en deux millilitres de PBS complétés par 0,1% d’interpolation 20 par lavage.

Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules avec un millilitre de 0,1 glycine molaire et 0,2%Triton X-100 en PBS pendant une heure à température ambiante suivie de trois lavages en PBS plus Tween 20 comme nous venons de le démontrer. Ensuite, utilisez une pointe de charge de 10 microlitres reliée à un vide pour perturber doucement la couche supérieure de collagène et bloquer toute liaison non spécifique avec un millilitre d’albumine sérique bovine de 5 % dans PBS Tween pendant deux heures. À la fin de l’incubation, ajouter les anticorps primaires d’intérêt dilués dans la solution de blocage à chaque plat et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, lavez la vaisselle avec trois lavages de 15 minutes dans le Tween PBS suivi de l’étiquetage avec les anticorps secondaires appropriés à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. À la fin de l’incubation, laver les cultures deux fois avec du préadolescent PBS et une fois avec de l’eau distillée comme démontré avant de monter le plat avec un milieu de montage anti-fondu pour la microscopie. Moins d’une journée après l’ensemencement dans les sandwichs au collagène 3D, les hépatocytes primaires de souris formaient des grappes et s’auto-organisaient dans un réseau environ régulier de bile canaliculi.

Dans les trois à six jours, des amas de cinq à dix cellules sont habituellement observés avec des hépatocytes entièrement polarisés formant un réseau canaliculaire. Le traitement avec la toxine ou les drogues cytosquelette-altération a comme résultat des changements dans le cytosquelette d’hépatocyte et la largeur, la forme, et le nombre de canaliculi de bile. Bien que le traitement à l’éthanol ne présente qu’un effet léger sur l’organisation de la kératine 8, il augmente la tortuosité et la distribution des largeurs canaliculaires biliaires.

L’intensité du signal de la coloration ZO-1 est diminuée dans le canaliculi bile traité à l’éthanol par rapport aux témoins non traités suggérant une perte de jonctions de type après le traitement à l’éthanol. L’inhibition de la contractilité actomyosine avec Blebbistatin induit la formation de canaliculi biliaire désordonné, épais et arrondi. En outre, le traitement à l’acide okadaïque inhibe les phosphatases affectant fortement les propriétés physiques des kératines et entraînant la bile canaliculi qui sont significativement réduites par rapport aux témoins non traités.

En outre, le traitement d’éthanol élève de manière significative les niveaux des transferases d’aminé d’alanine et d’aspartate suggérant des dommages hépatocellulaires graves tandis que le traitement de Blebbistatin ne mène à aucun changement de considération dans des niveaux de transaminase et le traitement d’acide okadaic déclenche des changements biochimiques doux dans l’aminotransferase d’alanine mais aucun changement dans l’expression aspartate d’aminotransferase. Il est important de continuer à travailler relativement rapidement pendant la cannulation et au début de la perfusion et d’éviter que des bulles n’entrent dans le système de perfusion. Les lysates cellulaires peuvent être recueillis dans des puits en double pour des protéines d’intérêt afin de déterminer si des changements dans l’expression des protéines et/ou les stades d’activation se produisent pendant le traitement.