Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte
October 20th, 2020
Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.
Notre protocole étudie l’infection fongique du point de vue de l’hôte et de l’agent pathogène afin d’identifier les interactions entre les systèmes biologiques qui sont critiques pour une maladie. Nous pouvons détecter à la fois les protéines fongiques et les protéines de l’hôte en une seule expérience et identifier les protéines fongiques produites uniquement lors de l’infection, représentant de nouvelles protéines associées à l’infection. Bien que nous nous concentrions sur le traitement des infections fongiques en découvrant de nouvelles stratégies anti-virulentes pour le traitement, notre pipeline de protéomique et de bio-informatique est universel et pourrait être appliqué à de nombreux systèmes biologiques.
Notre approche jette les bases de l’étude de différents agents pathogènes et de nombreuses réponses immunitaires et peut être utilisée pour fournir de nouvelles informations sur la relation entre le cryptocoque et le système immunitaire inné. La réponse des macrophages aux agents pathogènes et la détection d’un nombre suffisant de protéines fongiques sont importantes. Par conséquent, il est recommandé de tester et d’optimiser les MOI et les points temporels pour chaque espèce.
Comme la culture de macrophages et de cellules fongiques peut être difficile, il est important de savoir à quoi s’attendre après la coculture. La visualisation donne au chercheur la confiance nécessaire à la mise en œuvre de la procédure. Pour préparer les cellules fongiques à une infection par les macrophages, prélever et centrifuger des cellules de C neoformans à partir d’une culture en phase moyenne longue, suivie de trois lavages doux avec un millilitre de PBS à température ambiante dans les mêmes conditions de centrifugation.
Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules fongiques à raison de 1,2 fois 10 à huit cellules par millilitre de culture de cellules libres d’antibiotiques, à une concentration moyenne et ajouter un millilitre de suspension de cellules fongiques dans chacun des quatre puits d’une plaque de culture de macrophages à six puits confluents de 70 à 80 %. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Inclinez soigneusement la plaque pour permettre à chaque puits d’être lavé doucement trois fois avec un millilitre de PBS par puits et par lavage.
Pour mesurer la compétence en matière d’infection après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu sans antibiotique dans chaque puits de la plaque à six puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Aux points expérimentaux appropriés, prélever le surnageant de chaque puits et mesurer la quantité de LDH dans chaque puits conformément aux protocoles standard. Aux mêmes points, lysez les cellules macrophages non infectées pour déterminer la valeur de cytotoxicité maximale.
La cytotoxicité peut ensuite être calculée à l’aide de la formule indiquée. Pour la collecte et la co-culture de macrophages non infectés, ajoutez un millilitre de PBS froid à chaque puits de macrophages non infectés. Au bout d’une minute, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules du fond des puits et regroupez les suspensions de cellules dans un seul tube de 15 millilitres.
Collectez les cellules par centrifugation et éliminez complètement le surnageant pour permettre une congélation instantanée immédiate de la pastille dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés. L’analyse en composantes principales du processus par rapport aux ensembles de données révèle que, comme prévu, la composante la plus importante de séparation entre les données est celle des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés. La deuxième caractéristique distinctive des échantillons est leur variabilité biologique.
La combinaison d’une corrélation de Pearson avec un regroupement hiérarchique par distance euclidienne montre un regroupement distinct des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés avec une reproductibilité de réplication allant de 95 % à 96 %. Dans cette analyse, 117 protéines de l’hôte présentant un changement significatif de l’expression lors de l’infection ont été identifiées. Notamment, des augmentations significatives de l’abondance des protéines fongiques, comme prévu lors de l’infection, ont également été observées.
Il est important de manipuler les macrophages avec douceur pendant la coculture, le lavage et la collecte des échantillons. En définissant comment l’agent pathogène s’adapte à l’hôte et comment celui-ci se défend contre l’infection, de nouvelles connaissances sont acquises dans les domaines de la microbiologie et de l’immunologie.
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Aperçu
Ce protocole étudie l'interaction entre l'hôte et le pathogène lors d'une infection fongique en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Il permet la détection des protéines de l'hôte et du pathogène dans une seule expérience, fournissant des informations sur les protéines associées à l'infection.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Maladie infectieuse
- Protéomique
Contexte
- Comprendre les interactions hôte-pathogène est essentiel pour la recherche sur les maladies.
- Les infections fongiques posent des risques importants pour la santé, nécessitant de nouvelles stratégies de traitement.
- La protéomique peut révéler les changements dans l'abondance des protéines pendant l'infection.
- Les macrophages jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire aux pathogènes.
Objectif de l'étude
- Profilage des interactions entre les macrophages de l'hôte et le pathogène Cryptococcus neoformans.
- Identification de nouvelles protéines associées à l'infection produites lors d'une infection fongique.
- Établissement d'un pipeline de protéomique et de bioinformatique universel applicable à divers systèmes biologiques.
Méthodes utilisées
- Protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour la détection des protéines.
- Quantification sans marquage pour mesurer les changements d'abondance protéique.
- Optimisation de la multiplicité d'infection (MOI) et des points temporels pour des résultats précis.
- Analyse bioinformatique pour interpréter les données protéomiques.
Résultats principaux
- Identification des protéines fongiques spécifiquement produites pendant l'infection.
- Aperçu de la réponse des macrophages à Cryptococcus neoformans.
- Établissement d'un cadre pour l'étude de divers pathogènes et réponses immunitaires.
- Démonstration de l'applicabilité du protocole à différents systèmes biologiques.
Conclusions
- Le protocole fournit une approche globale pour étudier les interactions hôte-pathogène.
- Il pose les bases de recherches futures sur les infections fongiques et les réponses immunitaires.
- Une optimisation supplémentaire des conditions expérimentales est recommandée pour différentes espèces.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
