Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte

Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.

Notre protocole étudie l’infection fongique du point de vue de l’hôte et de l’agent pathogène afin d’identifier les interactions entre les systèmes biologiques qui sont critiques pour une maladie. Nous pouvons détecter à la fois les protéines fongiques et les protéines de l’hôte en une seule expérience et identifier les protéines fongiques produites uniquement lors de l’infection, représentant de nouvelles protéines associées à l’infection. Bien que nous nous concentrions sur le traitement des infections fongiques en découvrant de nouvelles stratégies anti-virulentes pour le traitement, notre pipeline de protéomique et de bio-informatique est universel et pourrait être appliqué à de nombreux systèmes biologiques.

Notre approche jette les bases de l’étude de différents agents pathogènes et de nombreuses réponses immunitaires et peut être utilisée pour fournir de nouvelles informations sur la relation entre le cryptocoque et le système immunitaire inné. La réponse des macrophages aux agents pathogènes et la détection d’un nombre suffisant de protéines fongiques sont importantes. Par conséquent, il est recommandé de tester et d’optimiser les MOI et les points temporels pour chaque espèce.

Comme la culture de macrophages et de cellules fongiques peut être difficile, il est important de savoir à quoi s’attendre après la coculture. La visualisation donne au chercheur la confiance nécessaire à la mise en œuvre de la procédure. Pour préparer les cellules fongiques à une infection par les macrophages, prélever et centrifuger des cellules de C neoformans à partir d’une culture en phase moyenne longue, suivie de trois lavages doux avec un millilitre de PBS à température ambiante dans les mêmes conditions de centrifugation.

Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules fongiques à raison de 1,2 fois 10 à huit cellules par millilitre de culture de cellules libres d’antibiotiques, à une concentration moyenne et ajouter un millilitre de suspension de cellules fongiques dans chacun des quatre puits d’une plaque de culture de macrophages à six puits confluents de 70 à 80 %. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Inclinez soigneusement la plaque pour permettre à chaque puits d’être lavé doucement trois fois avec un millilitre de PBS par puits et par lavage.

Pour mesurer la compétence en matière d’infection après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu sans antibiotique dans chaque puits de la plaque à six puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Aux points expérimentaux appropriés, prélever le surnageant de chaque puits et mesurer la quantité de LDH dans chaque puits conformément aux protocoles standard. Aux mêmes points, lysez les cellules macrophages non infectées pour déterminer la valeur de cytotoxicité maximale.

La cytotoxicité peut ensuite être calculée à l’aide de la formule indiquée. Pour la collecte et la co-culture de macrophages non infectés, ajoutez un millilitre de PBS froid à chaque puits de macrophages non infectés. Au bout d’une minute, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules du fond des puits et regroupez les suspensions de cellules dans un seul tube de 15 millilitres.

Collectez les cellules par centrifugation et éliminez complètement le surnageant pour permettre une congélation instantanée immédiate de la pastille dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés. L’analyse en composantes principales du processus par rapport aux ensembles de données révèle que, comme prévu, la composante la plus importante de séparation entre les données est celle des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés. La deuxième caractéristique distinctive des échantillons est leur variabilité biologique.

La combinaison d’une corrélation de Pearson avec un regroupement hiérarchique par distance euclidienne montre un regroupement distinct des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés avec une reproductibilité de réplication allant de 95 % à 96 %. Dans cette analyse, 117 protéines de l’hôte présentant un changement significatif de l’expression lors de l’infection ont été identifiées. Notamment, des augmentations significatives de l’abondance des protéines fongiques, comme prévu lors de l’infection, ont également été observées.

Il est important de manipuler les macrophages avec douceur pendant la coculture, le lavage et la collecte des échantillons. En définissant comment l’agent pathogène s’adapte à l’hôte et comment celui-ci se défend contre l’infection, de nouvelles connaissances sont acquises dans les domaines de la microbiologie et de l’immunologie.