Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte
20 octobre 2020
Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.
Notre protocole étudie l’infection fongique du point de vue de l’hôte et de l’agent pathogène afin d’identifier les interactions entre les systèmes biologiques qui sont critiques pour une maladie. Nous pouvons détecter à la fois les protéines fongiques et les protéines de l’hôte en une seule expérience et identifier les protéines fongiques produites uniquement lors de l’infection, représentant de nouvelles protéines associées à l’infection. Bien que nous nous concentrions sur le traitement des infections fongiques en découvrant de nouvelles stratégies anti-virulentes pour le traitement, notre pipeline de protéomique et de bio-informatique est universel et pourrait être appliqué à de nombreux systèmes biologiques.
Notre approche jette les bases de l’étude de différents agents pathogènes et de nombreuses réponses immunitaires et peut être utilisée pour fournir de nouvelles informations sur la relation entre le cryptocoque et le système immunitaire inné. La réponse des macrophages aux agents pathogènes et la détection d’un nombre suffisant de protéines fongiques sont importantes. Par conséquent, il est recommandé de tester et d’optimiser les MOI et les points temporels pour chaque espèce.
Comme la culture de macrophages et de cellules fongiques peut être difficile, il est important de savoir à quoi s’attendre après la coculture. La visualisation donne au chercheur la confiance nécessaire à la mise en œuvre de la procédure. Pour préparer les cellules fongiques à une infection par les macrophages, prélever et centrifuger des cellules de C neoformans à partir d’une culture en phase moyenne longue, suivie de trois lavages doux avec un millilitre de PBS à température ambiante dans les mêmes conditions de centrifugation.
Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules fongiques à raison de 1,2 fois 10 à huit cellules par millilitre de culture de cellules libres d’antibiotiques, à une concentration moyenne et ajouter un millilitre de suspension de cellules fongiques dans chacun des quatre puits d’une plaque de culture de macrophages à six puits confluents de 70 à 80 %. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. Inclinez soigneusement la plaque pour permettre à chaque puits d’être lavé doucement trois fois avec un millilitre de PBS par puits et par lavage.
Pour mesurer la compétence en matière d’infection après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu sans antibiotique dans chaque puits de la plaque à six puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Aux points expérimentaux appropriés, prélever le surnageant de chaque puits et mesurer la quantité de LDH dans chaque puits conformément aux protocoles standard. Aux mêmes points, lysez les cellules macrophages non infectées pour déterminer la valeur de cytotoxicité maximale.
La cytotoxicité peut ensuite être calculée à l’aide de la formule indiquée. Pour la collecte et la co-culture de macrophages non infectés, ajoutez un millilitre de PBS froid à chaque puits de macrophages non infectés. Au bout d’une minute, tapotez doucement la plaque pour détacher les cellules du fond des puits et regroupez les suspensions de cellules dans un seul tube de 15 millilitres.
Collectez les cellules par centrifugation et éliminez complètement le surnageant pour permettre une congélation instantanée immédiate de la pastille dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés. L’analyse en composantes principales du processus par rapport aux ensembles de données révèle que, comme prévu, la composante la plus importante de séparation entre les données est celle des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés. La deuxième caractéristique distinctive des échantillons est leur variabilité biologique.
La combinaison d’une corrélation de Pearson avec un regroupement hiérarchique par distance euclidienne montre un regroupement distinct des échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés avec une reproductibilité de réplication allant de 95 % à 96 %. Dans cette analyse, 117 protéines de l’hôte présentant un changement significatif de l’expression lors de l’infection ont été identifiées. Notamment, des augmentations significatives de l’abondance des protéines fongiques, comme prévu lors de l’infection, ont également été observées.
Il est important de manipuler les macrophages avec douceur pendant la coculture, le lavage et la collecte des échantillons. En définissant comment l’agent pathogène s’adapte à l’hôte et comment celui-ci se défend contre l’infection, de nouvelles connaissances sont acquises dans les domaines de la microbiologie et de l’immunologie.
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Aperçu
Ce protocole étudie l'interaction entre l'hôte et l'agent pathogène lors d'une infection fongique en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Il permet la détection des protéines de l'hôte et de l'agent pathogène dans une seule expérience, offrant ainsi des informations sur les protéines associées à l'infection.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Maladie infectieuse
- Protéomique
Contexte
- La compréhension des interactions hôte-pathogène est essentielle pour la recherche sur les maladies.
- Les infections fongiques représentent des risques importants pour la santé, nécessitant des stratégies thérapeutiques innovantes.
- La protéomique peut révéler les changements d'abondance des protéines durant l'infection.
- Les macrophages jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire contre les agents pathogènes.
Objectif de l'étude
- Caractériser les interactions entre les macrophages de l'hôte et l'agent pathogène Cryptococcus neoformans.
- Identifier de nouvelles protéines associées à l'infection produites durant l'infection fongique.
- Mettre en place un protocole universel de protéomique et de bioinformatique applicable à divers systèmes biologiques.
Méthodes utilisées
- Protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour la détection de protéines.
- Quantification sans marquage pour mesurer les variations d'abondance des protéines.
- Optimisation de la multiplicité d'infection (MOI) et des points temporels pour des résultats précis.
- Analyse bioinformatique pour interpréter les données protéomiques.
Résultats principaux
- Identification des protéines fongiques produites spécifiquement pendant l'infection.
- Connaissances approfondies sur la réponse des macrophages à Cryptococcus neoformans.
- Mise en place d'un cadre pour l'étude de divers agents pathogènes et réponses immunitaires.
- Démonstration de l'applicabilité du protocole à différents systèmes biologiques.
Conclusions
- Le protocole offre une approche complète pour l'étude des interactions hôte-pathogène.
- Il jette les bases de recherches futures sur les infections fongiques et les réponses immunitaires.
- Une optimisation supplémentaire des conditions expérimentales est recommandée pour différentes espèces.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole de protéomique quantitative sans marquage permet le profilage simultané des protéomes de l'hôte et de l'agent pathogène pendant l'infection, fournissant des données objectives sur l'abondance des protéines, essentielles pour la validation des cibles en recherche sur les maladies infectieuses. En identifiant les protéines fongiques associées à l'infection et les signatures de la réponse de l'hôte, cette méthode soutient une détection mécanistique des stratégies anti-virulence et oriente le choix préclinique des cibles. Sa transférabilité entre différents systèmes hôte-pathogène renforce son applicabilité à l'ensemble du portefeuille de programmes de découverte d'antifongiques et d'agents immunomodulateurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en identifiant des protéines de pathogènes produites exclusivement pendant l'infection, représentant ainsi de nouvelles cibles associées à la virulence.
- Valeur scientifique : Clarifie les voies d'interaction hôte-pathogène grâce à des changements corrélés d'abondance dans les deux protéomes, soutenant ainsi la validation fonctionnelle des cibles.
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant des profils protéomiques quantitatifs et reproductibles selon l'état d'infection, permettant ainsi de minimiser les risques liés aux hypothèses sur les cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur opérationnelle : Prépare des systèmes biologiques validés (macrophages infectés) pour le développement de tests en aval, avec des conditions d'infection standardisées et une optimisation du MOI.
- Valeur opérationnelle : Génère des données protéomiques quantitatives et sans marquage, adaptées à la standardisation des tests et à l'évaluation de la reproductibilité dans les campagnes de criblage.
- Valeur opérationnelle : Permet une réutilisation évolutive de la plateforme pour divers pathogènes grâce à la conception universelle du pipeline protéomique et bioinformatique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Identifie les protéines hôtes pertinentes pour la maladie qui répondent à l'invasion microbienne, permettant l'alignement de biomarqueurs pour la validation préclinique.
- Valeur translationnelle : Assure la continuité entre la découverte et les travaux précliniques en reliant les modifications protéomiques liées à l'état d'infection aux mécanismes pathogènes.
- Valeur translationnelle : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en mettant en évidence les protéines essentielles aux mécanismes de virulence et de défense de l'hôte.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le flux de travail s'intègre à la biologie de la découverte précoce par l'analyse des interactions hôte-pathogène, soutient la préparation au criblage grâce à des modèles d'infection standardisés et permet la recherche translationnelle en reliant les modifications protéomiques aux mécanismes de virulence et de réponse immunitaire.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant les modifications induites par l'infection dans les protéomes de l'hôte et du pathogène.
- Écrans de sélection : Fournit des systèmes biologiques prêts à l'emploi avec un MOI et des points temporels optimisés, assurant des modèles d'infection reproductibles pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Offre des mesures quantitatives sans marquage et des résultats statistiques (par exemple, tests t corrigés selon Benjamini-Hochberg) pour comparer les conditions et identifier les protéines significativement modifiées.
- Recherche translationnelle : Associe les signatures protéomiques aux mécanismes pathogènes et aux réponses de défense de l'hôte, soutenant ainsi la découverte de biomarqueurs et la continuité préclinique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un flux de travail réutilisable en protéomique et en bioinformatique, applicable à plusieurs pathogènes et systèmes immunitaires, réduisant ainsi les développements méthodologiques redondants.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à un profilage protéomique quantitatif et sans biais selon l'état d'infection.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par des protocoles optimisés de coculture, de lavage et de lyse, associés à des métriques de contrôle qualité validées (ACP, regroupement, reproductibilité de 95 à 96 % entre réplicats).
- Valeur stratégique : Affine les décisions de poursuite ou d'abandon en révélant des facteurs de virulence essentiels et des réseaux de réponse de l'hôte, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée des programmes antifongiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en fonction de l'expression protéique spécifique à l'infection et de l'implication dans des voies métaboliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire de mammifères et de champignons, en préparation d'échantillons pour la protéomique et en analyse de données de spectrométrie de masse.
- Dépend de l'accès à un équipement de LC-MS/MS, à un logiciel de quantification sans marquage isotopique et à des outils bioinformatiques pour l'analyse en composantes principales (ACP), le regroupement en clusters et l'analyse d'expression différentielle.
- Exige une standardisation interéquipes des paramètres d'infection (IO, points temporels) et de la manipulation des échantillons afin d'assurer la reproductibilité entre les études.
- Implique des adaptations selon les systèmes hôte-pathogène, notamment l'optimisation de la préparation des cellules fongiques et de la confluence des macrophages.
- Les limitations pratiques incluent la difficulté technique de détecter des protéines fongiques peu abondantes au milieu de signaux d'origine hôte très intenses, ce qui nécessite une profondeur d'infection et une sensibilité suffisantes.
