Name: Évaluation de l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau à l’aide de signatures moléculaires microbiennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez comment évaluer l'impact de la fracturation hydraulique sur les communautés microbiennes des cours d'eau. Cette méthode complète couvre la collecte d'échantillons, l'extraction d'acides nucléiques et le séquençage 16S rRNA pour analyser la biodiversité bactérienne.

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Les auteurs aimeraient reconnaître les sources de financement pour les projets qui ont conduit au développement de ces méthodes, ces sources étant: le Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) par le biais du programme d’enseignement des sciences préuniversitaire et de premier cycle, ainsi que par la National Science Foundation (http://www.nsf.gov) par le biais des prix NSF DBI-1248096 et CBET-1805549.

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<li>Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+risks+of+shale+oil+and+gas+development+to+wildlife%2C+aquatic+resources%2C+and+their+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats.</a> Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).</li>
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<li>Rausch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+amplicon+and+metagenomic+sequencing+methods+reveals+key+features+in+the+evolution+of+animal+metaorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms.</a> Microbiome. 7 (1), 133(2019).</li>
<li>Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+16S+rRNA+gene+copy+numbers+in+microbiome+surveys+remains+an+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem.</a> Microbiome. 6 (1), 41(2018).</li>
<li>Trexler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+impacts+of+unconventional+natural+gas+extraction+on+microbial+communities+in+headwater+stream+ecosystems+in+Northwestern+Pennsylvania%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 522(2014).</li>
<li>Mumford, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shale+gas+development+has+limited+effects+on+stream+biology+and+geochemistry+in+a+gradient-based%2C+multiparameter+study+in+Pennsylvania%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).</li>
<li>JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: 
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<li>Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: 
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<li>ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html</a> (2020).</li>
<li>QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: 
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<li>ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: 
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<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
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<li>Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki">https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki</a> (2020).</li>
<li>Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permutational+multivariate+analysis+of+variance+%28PERMANOVA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+StatsRef%3A+Statistics+Reference+Online%22%5BJournal%5D)">Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA).</a> Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites dans cet article ont été développées et affinées au cours de plusieurs études publiées par notre groupe entre 2014 et 2018 7,8,10 et ont été utilisées avec succès dans un projet collaboratif visant à étudier les impacts de la fracturation hydraulique sur les communautés aquatiques dans un projet de trois ans qui soumettra bientôt un article pour publication. Ces méthodes continueront d’être utilisées pendant le reste du projet. En outre, d’autres publications actuelles sur l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau et les écosystèmes décrivent des méthodes similaires de collecte, de traitement etd’analysedes échantillons7,8,10,11. Cependant, aucun de ces articles n’a utilisé l’analyse métatranscriptomique, ce qui fait de cet article le premier à décrire comment ces analyses peuvent être utilisées pour élucider l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau voisins. De plus, les méthodes présentées ici pour le prélèvement d’échantillons sont plus détaillées, tout comme les mesures prises pour éviter la contamination.
L’une des étapes les plus importantes de notre protocole est la collecte et la conservation initiales des échantillons. L’échantillonnage et la collecte sur le terrain comportent certains défis, car il peut être difficile de maintenir un environnement aseptique ou stérile pendant la collecte. Au cours de cette étape, il est essentiel d’éviter de contaminer les échantillons. Pour ce faire, des gants doivent être portés et seuls les contenants et les outils stériles doivent être autorisés à entrer en contact avec les échantillons. Les échantillons doivent également être immédiatement placés sur la glace après le prélèvement afin d’atténuer la dégradation des acides nucléiques. L’ajout d’un agent de conservation commercial des acides nucléiques lors de la collecte peut également augmenter le rendement en acides nucléiques et permettre aux échantillons d’être conservés pendant de plus longues périodes après la collecte. Chaque fois que l’extraction d’acide nucléique est effectuée, il est important d’utiliser la quantité appropriée d’échantillon, trop peut obstruer les filtres de spin utilisés pour l’extraction (pour les protocoles qui les utilisent), mais trop peu peut entraîner de faibles rendements. Assurez-vous de suivre les instructions pour le kit utilisé.
À l’instar de la collecte sur le terrain, il est également important d’éviter ou de minimiser la contamination lors de l’extraction et de la préparation des échantillons d’acides nucléiques, en particulier lorsque vous travaillez avec des échantillons à faible rendement en acides nucléiques, tels que des échantillons de sédiments sous-optimaux (échantillons contenant une grande quantité de gravier ou de roches) ou des échantillons d’eau. Par conséquent, comme pour le prélèvement d’échantillons, des gants doivent être portés pendant toutes ces étapes afin de réduire la contamination. De plus, toutes les surfaces de travail utilisées pendant les procédures de laboratoire doivent être stérilisées au préalable en essuyant avec une solution d’eau de Javel à 10%, suivie d’une solution d’éthanol à 70%. Pour les étapes de pipetage (3-6), les embouts de filtre doivent être utilisés pour éviter la contamination due à la pipette elle-même, les embouts étant changés chaque fois qu’ils touchent une surface non stérile. Tous les outils utilisés pour les travaux de laboratoire, y compris les pipettes, doivent être essuyés avant et après avec les solutions d’eau de Javel et d’éthanol. Pour évaluer la contamination, les blancs et les négatifs d’extraction (liquide stérile) doivent être inclus lors de chaque série d’extractions d’acides nucléiques et de réactions de PCR. Si la quantification après les extractions révèle une quantité détectable d’ADN/ARN dans les négatifs, les extractions peuvent être répétées s’il reste suffisamment d’échantillon. Si des échantillons négatifs pour la PCR montrent une amplification, un dépannage doit être effectué pour déterminer la source, puis les échantillons doivent être réexécutés. Pour tenir compte des faibles niveaux de contamination, il est recommandé de séquencer les blancs d’extraction et les négatifs pcR afin que les contaminants puissent être identifiés et éliminés, si nécessaire, lors de l’analyse informatique. Inversement, l’amplification par PCR pourrait également échouer en raison de diverses causes. Pour les échantillons environnementaux, l’inhibition de la réaction PCR est souvent le coupable, ce qui peut être dû à une variété de substances interférant avec la Taq polymérase23. Si une inhibition est suspectée, de l’eau de qualité PCR (voir Tableau des matériaux)peut être utilisée pour diluer les extraits d’ADN.
Ce protocole présente quelques limites notables et difficultés potentielles. La collecte d’échantillons peut être difficile pour les échantillons d’eau et de sédiments. Afin d’obtenir suffisamment de biomasse, idéalement, 1 L d’eau de ruisseau doit être poussé à travers un filtre. Les pores du filtre doivent être petits pour capturer les microbes, mais peuvent également piéger les sédiments. Si beaucoup de sédiments sont dans l’eau en raison des précipitations récentes, le filtre peut se boucher, ce qui rend difficile de pousser tout le volume à travers le filtre. Pour la collecte des sédiments, il peut être difficile d’estimer la profondeur des sédiments pendant la collecte. De plus, il est important de s’assurer que les sédiments recueillis sont principalement du sol, car les cailloux et les roches entraîneront une baisse du rendement en acides nucléiques et peuvent ne pas être une représentation précise de la communauté microbienne. Enfin, il est également essentiel que les échantillons soient conservés sur la glace après la collecte, surtout si un agent de conservation n’est pas utilisé.
Bien que ce protocole couvre à la fois la métatranscriptomique et les protocoles de laboratoire 16S, il convient de souligner que ces deux méthodes sont très différentes à la fois dans le processus et dans le type de données qu’elles fournissent. Le gène de l’ARNr 16S est une région couramment ciblée, hautement conservée dans les bactéries et les archées, et utile pour caractériser la communauté bactérienne dans un échantillon. Bien qu’il s’agit d’une approche ciblée et spécifique, la résolution au niveau de l’espèce est souvent inaccessible, et il est difficile de caractériser les espèces ou les souches nouvellement divergentes. Au contraire, la métatranscriptomique est une approche plus large qui capture tous les gènes actifs et les microbes présents dans un échantillon. Alors que 16S ne fournit que des données pour l’identification, la métatranscriptomique peut fournir des données fonctionnelles telles que les gènes exprimés et les voies métaboliques. Les deux sont précieux et lorsqu’ils sont combinés, ils peuvent révéler quelles bactéries sont présentes et quels gènes ils expriment.
Cet article décrit les méthodes de collecte sur le terrain et de traitement des échantillons pour les analyses d’ARNr 16S et métatranscriptomiques dans le contexte de l’étude de la fracturation hydraulique. En outre, il détaille les méthodes de collecte d’ADN / ARN de haute qualité à partir d’échantillons à faible biomasse et pour le stockage à long terme. Les méthodes décrites ici sont l’aboutissement de nos expériences en matière de collecte et de traitement d’échantillons dans le cadre de nos efforts visant à apprendre l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau voisins en examinant la structure et la fonction de leurs communautés microbiennes. Les microbes réagissent rapidement aux perturbations et, par conséquent, quels microbes sont présents et les gènes qu’ils expriment peuvent fournir des informations sur les effets de la fracturation hydraulique sur les écosystèmes. Dans l’ensemble, ces méthodes pourraient être inestimables pour comprendre l’impact de la fracturation hydraulique sur ces écosystèmes importants.

La fracturation hydraulique (HF), ou « fracturation », est une méthode d’extraction de gaz naturel, qui est devenue de plus en plus répandue à mesure que la demande de combustibles fossiles continue d’augmenter. Cette technique consiste à utiliser des équipements de forage de grande puissance pour injecter un mélange d’eau, de sable et de produits chimiques dans des gisements de schiste riches en méthane, généralement pour libérer des gaz piégés1.
Étant donné que ces techniques de récolte non conventionnelles sont relativement nouvelles, il est important d’étudier les effets de telles pratiques sur les cours d’eau avoisinants. Les activités de fracturation hydraulique exigent le défrichement de vastes étendues de terrain pour le transport de l’équipement et la construction de plates-formes de puits. Environ 1,2 à 1,7 hectare de terrain doivent être défrichés pour chaque plate-forme de puits2,ce qui pourrait avoir une incidence sur le ruissellement et la qualité de l’eau du système3. Il y a un manque de transparence concernant la composition chimique exacte du fluide de fracturation, y compris les biocides utilisés. De plus, les eaux usées de fracturation ont tendance à être trèssalines 2. En outre, les eaux usées peuvent contenir des métaux et des substances radioactives naturelles2. Par conséquent, la possibilité de fuites et de déversements de liquide de fracturation dus à une erreur humaine ou à un dysfonctionnement de l’équipement est préoccupante.
Les écosystèmes fluviaux sont connus pour être très sensibles aux changements dans les paysages environnants4 et sont importants pour le maintien de la biodiversité5 et le cycle approprié des nutriments6 dans l’ensemble du bassin versant. Les microbes sont les organismes les plus abondants dans les cours d’eau douce et sont donc essentiels au cycle des nutriments, à la biodégradation et à la production primaire. La composition et la fonction de la communauté microbienne sont d’excellents outils pour obtenir des informations sur l’écosystème en raison de leur sensibilité à la perturbance, et des recherches récentes ont montré des changements distincts dans les assemblages bactériens observés en fonction de la proximité de l’activité de fracturation7,8. Par exemple, Beijerinckia, Burkholderiaet Methanobacterium ont été identifiés comme enrichis dans des cours d’eau proches de la fracturation hydraulique tandis que Pseudonocardia, Nitrospiraet Rhodobacter ont été enrichis dans les cours d’eau non proches de la fracturation7.
Le séquençage de nouvelle génération du gène de l’ARN ribosomique (ARNr) 16S est une méthode abordable de détermination de la composition de la communauté bactérienne qui est plus rapide et moins chère que le séquençage du génome entierapproche 9. Une pratique courante dans le domaine de l’écologie moléculaire consiste à utiliser la région V4 très variable du gène de l’ARNr 16S pour la résolution du séquençage, souvent jusqu’au niveau du genre avec un large champ d’identification9, car elle est idéale pour les échantillons environnementaux imprévisibles. Cette technique a été largement mise en œuvre dans des études publiées et a été utilisée avec succès pour identifier l’impact des opérations de fracturation sur les milieux aquatiques7,8. Cependant, il convient de noter que les bactéries ont des nombres de copies variables du gène de l’ARNr 16S, ce qui affecte leur abondance détectée10. Il existe quelques outils pour expliquer cela, mais leur efficacité est discutable10. Une autre pratique dont la prévalence augmente rapidement et qui n’a pas cette faiblesse est le séquençage métatranscriptomique, dans lequel tout l’ARN est séquencé, ce qui permet aux chercheurs d’identifier à la fois les bactéries actives et l’expression de leurs gènes.
Par conséquent, contrairement aux méthodes utilisées dans les études7,8 ,11,12publiées précédemment, ce protocole couvre également la collecte, la conservation, le traitement et l’analyse d’échantillons pour étudier la fonction de la communauté microbienne (métatranscriptomique). Les étapes détaillées ici permettent aux chercheurs de voir quel impact, le cas échéant, la fracturation hydraulique a eu sur les gènes et les voies exprimés par les microbes dans leurs flux, y compris les gènes de résistance aux antimicrobiens. De plus, le niveau de détail présenté pour la collecte d’échantillons est amélioré. Bien que plusieurs des étapes et des notes puissent sembler évidentes pour les chercheurs expérimentés, elles pourraient être inestimables pour ceux qui commencent tout juste la recherche.
Nous décrivons ici les méthodes de collecte et de traitement des échantillons afin de générer des données génétiques bactériennes afin d’étudier l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau voisins sur la base de plusieurs années d’expérience de nos laboratoires. Ces données peuvent être utilisées dans les applications en aval pour identifier les différences correspondant à l’état de la fracturation.

<table><tbody><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>400 mL doivent être ajoutés au tampon PE (voir le protocole du kit d’extraction de gel Qiagen QIAQuck) et 96 mL doivent être ajoutés au tampon de lavage de l’ADN/ARN (voir le protocole du kit Miniprep ZymoBIOMICS DNA/NNA). De l’éthanol supplémentaire est nécessaire pour le ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep et NEBNext&reg ; Ultra&commerce ; II Préparation de la banque d’ARN avec des kits de perles de purification d’échantillons.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>100 g par bouteille. 0,6 g d’agarose serait nécessaire pour faire un gel à 2 % 30 ml.</td></tr><tr><td>Eau de Javel désinfectante</td><td>Walmart (Clorox)</td><td>Aucun numéro de catalogue</td><td>Utilisez une solution d’eau de Javel à 10 % pour nettoyer la zone de travail avant et après les procédures de laboratoire</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Chaque colorant fabriqué par l’utilisateur (c’est-à-dire sans e-gel) doit inclure un colorant de chargement avec tous les échantillons dans le rapport de 1 & micro ; L colorant à 5 &micro ; Échelle</td></tr><tr><td>d’ADN d’échantillon</td><td>L MilliporeSigma</td><td>D3937-1VL</td><td>Une échelle doit être exécutée sur chaque</td></tr><tr><td>bouclier d’ADN/ARN</td> gel/e-gel (2x)<td>Zymo Research</td><td>R1200-125</td><td>3 mL par échantillon de sédiment (50 mL conique) et 2 mL par échantillon d’eau (filtre)</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td>Utilisé pour la coloration des e-gels fabriqués par l’utilisateur</td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td>51-01-19-06</td><td>0,5 et micro ; L par réaction PCR</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>563935-1L</td><td>Généralement moins de 2 mL par bibliothèque. Le volume nécessaire varie en fonction de la masse du fragment de gel excisé (voir le protocole du kit d’extraction de gel Qiagen QIAQuick).&nbsp ;</td></tr><tr><td>Eau de qualité PCR</td><td>MilliporeSigma</td><td>3315932001</td><td>13 & micro ; L par réaction PCR (en supposant 1 & micro ; L de la matrice d’ADN de l’échantillon est utilisée)</td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000012</td><td>10 &micro ; L par réaction PCR</td></tr><tr><td>Amorce inverse</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>51-01-19-07</td><td>0,5 & micro ; L par réaction PCR</td></tr><tr><td>Tampon TBE (Tris-borate-EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B52</td><td>1 L de 10 tampons TBE (30 ml de 1 tampon TBE seraient nécessaires pour fabriquer un gel de 30 mL)</td></tr><tr><td>1 bouteille de 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-893-4E</td><td>Un nécessaire par flux (la même bouteille peut être utilisée pour plusieurs flux si elle est stérilisée entre deux utilisations)</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes de microcentrifugation</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780400-450EA</td><td>5 tubes de microcentrifugation sont nécessaires pour l’extraction de l’ADN et 3 autres sont nécessaires pour purifier l’ARN (voir protocole du kit Miniprep ADN/ARN de ZymoBIOMICS)</td></tr><tr><td>E-GEL 2 % d’agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G401002</td><td>Chaque gel peut analyser 10 échantillons (donc 9 avec une PCR négative et 8 si l’extraction négative est effectuée sur le même gel)</td></tr><tr><td>50 mL Coniques</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td>1 50 mL conique nécessaire par échantillon de sédiment</td></tr><tr><td>500 mL Bécher</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z740580</td><td>Seulement 1 nécessaire (pour la stérilisation à la flamme)</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Walmart (Reynolds KITCHEN)</td><td>Aucun numéro</td><td>La feuille d’aluminium peut être pliée et autoclavée. La pièce non exposée à l’environnement peut alors être utilisée comme surface stérile, exempte d’ADN et d’ARN pour le traitement des filtres (une pièce pliée par filtre pour éviter la contamination croisée)</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Gettinge</td><td>LSS 130</td><td>Une seule</td></tr><tr><td>centrifugeuse</td><td>nécessaire MilliporeSigma</td><td>EP5404000138-1EA</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>refroidisseur</td> nécessaire <td>ULINE</td><td>S-22567</td><td>À peu près n’importe quelle glacière peut être utilisée. Celui-ci est répertorié en raison de sa fabrication en mousse, ce qui le rend plus léger et donc plus facile à emporter pour l’échantillonnage sur le terrain.</td></tr><tr><td>Disruptor Genie</td><td>Bio-Rad</td><td>3591456</td><td>Une seule chambre d’électrophorèse nécessaire</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1664000EDU</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>nécessaire Alimentation d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>nécessaire Congélateur (-20 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K204SDF</td><td>Un nécessaire pour stocker les extraits d’ADN</td></tr><tr><td>Congélateur (-80 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K205ULT</td><td>On a besoin de stocker des extraits d’ARN</td></tr><tr><td>Gants Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-020-352</td><td>Le numéro de catalogue est pour les gants moyens.</td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z741333-1EA</td><td>Un seul brûleur de</td></tr><tr><td>laboratoire</td><td>nécessaire Sterlitech</td><td>177200-00</td><td>Un seul nécessaire</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>AirClean Systems</td><td>AC624LFUV</td><td>Un seul</td></tr><tr><td>nécessaire Kit de purification de bibliothèque</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Un kit a assez pour 50 réactions</td></tr><tr><td>Plaque magnétique</td><td>Alpaqua</td><td>A001219</td><td>Un seul </td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td> nécessaire <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004061</td><td>Une seule</td></tr><tr><td>Micropipette nécessaire (1000 &micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>L-1000</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>Micropipette nécessaire (2 &micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>L-2</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>Micropipette nécessaire (20 &micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>L-20</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>Micropipette nécessaire (200 &micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>L-200R</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>nécessaire NEBNext Ultra II Préparation de la bibliothèque d’ARN avec billes de purification</td><td>d’échantillons New England BioLabs Inc.</td><td>E7775S</td><td>Un kit contient suffisamment de réactifs pour 24 échantillons.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7793-1EA</td><td>2 carrés de 1 » x 1 » sont nécessaires par filtre</td></tr><tr><td>Tubes PCR Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>Un tube nécessaire par réaction</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (pour 1000 &micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-1000</td><td>Pack de 576 pointes</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (pour 20 & micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-20</td><td>Pack de 960</td></tr><tr><td>pointes Pointes de pipette (pour 200 & micro ; L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-250</td><td>Pack de 960 pointes</td></tr><tr><td>Cluster d’ordinateurs PowerWulf ZXR1+</td><td>PSSC Labs</td><td>Pas de numéro</td><td>Ceci n’est qu’un exemple de supercalculateur suffisamment puissant pour effectuer une analyse métatranscriptomique en temps opportun. Il n’en faut qu’un.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de démarrage de fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33239</td><td>Livré avec un fluorimètre Qubit 4, suffisamment de réactif pour 100 dosages d’ADN et 500 tubes Qubit</td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Une seule</td></tr><tr><td>nécessaire Lames stériles</td><td>AD Surgical</td><td>A600-P10-0</td><td>Une nécessaire par filtre</td></tr><tr><td>Unité de filtration sous pression Sterivex-GP MilliporeSigma</td><td></td><td>SVGP01050</td><td>1 filtre nécessaire par échantillon d’eau</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>Un seul nécessaire</td></tr><tr><td>Vise-grip</td><td>Irwin</td><td>2078500</td><td>Un seul nécessaire (pour ouvrir les filtres)</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z258415-1EA</td><td>Seulement 1</td></tr><tr><td>sac WHIRL-PAK</td> NÉCESSAIRE <td>ULINE</td><td>S-22729</td><td>1 nécessaire par filtre</td></tr><tr><td>ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2002</td><td>Un kit contient suffisamment de réactifs pour 50 échantillons.</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau à l’aide de signatures moléculaires microbiennes

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

La fracturation hydraulique (HF), communément appelée « fracturation hydraulique », utilise un mélange d’eau à haute pression, de sable et de produits chimiques pour fracturer les roches, libérant du pétrole et du gaz. Ce processus a révolutionné l’industrie énergétique américaine, car il donne accès à des ressources qui étaient auparavant inaccessibles et produit maintenant les deux tiers du gaz naturel total aux États-Unis. Bien que la fracturation hydraulique ait eu un impact positif sur l’économie américaine, plusieurs études ont mis en évidence ses effets néfastes sur l’environnement. L’effet de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau d’amont, qui est particulièrement important en raison de leur impact disproportionné sur la santé de l’ensemble du bassin versant, est particulièrement préoccupant. Les bactéries à l’intérieur de ces cours d’eau peuvent être utilisées comme indicateurs de la santé des cours d’eau, car on s’attendrait à ce que les bactéries présentes et leur abondance dans un cours d’eau perturbé diffèrent de celles d’un cours d’eau autrement comparable mais non perturbé. Par conséquent, ce protocole vise à utiliser la communauté bactérienne pour déterminer si les cours d’eau ont été touchés par la fracturation hydraulique. À cette fin, des échantillons de sédiments et d’eau provenant de cours d’eau situés à proximité de la fracturation hydraulique (potentiellement touchés) et en amont ou dans un autre bassin versant d’activité de fracturation (non affecté) doivent être prélevés. Ces échantillons sont ensuite soumis à l’extraction d’acides nucléiques, à la préparation de la bibliothèque et au séquençage pour étudier la composition de la communauté microbienne. L’analyse corrélationnelle et les modèles d’apprentissage automatique peuvent ensuite être utilisés pour identifier les caractéristiques qui expliquent la variation dans la communauté, ainsi que pour identifier les biomarqueurs prédictifs de l’impact de la fracturation hydraulique. Ces méthodes peuvent révéler une variété de différences dans les communautés microbiennes entre les cours d’eau d’amont, en fonction de la proximité de la fracturation hydraulique, et servir de base à de futures études sur l’impact environnemental des activités de fracturation.

Le succès des extractions d’ADN et d’ARN peut être évalué à l’aide d’une variété d’équipements et de protocoles. En général, toute concentration détectable de l’un ou l’autre est considérée comme suffisante pour conclure que l’extraction a réussi. En examinant le tableau 1, toutes les extractions, à l’exception d’une seule, seraient qualifiées de réussies. L’échec à cette étape est souvent dû à une faible biomasse initiale, à une mauvaise conservation de l’échantillon ou à une erreur humaine lors de l’extraction. Dans le cas des filtres, l’extraction peut avoir réussi même si la concentration est inférieure à la détection. Si ces extraits ne donnent pas de bandes pour la PCR (si vous faites 16S) ou une concentration détectable après la préparation de la bibliothèque (métatranscriptomique), alors ils ont probablement vraiment échoué.
Si le protocole 16S est suivi, les bandes lumineuses suivant l’amplification par PCR, comme on le voit dans les puits 4 et 6 de la figure 1,indiquent un succès, tandis qu’un manque de bandes, comme on le voit dans les autres puits de la rangée supérieure, indique une défaillance. De plus, une bande lumineuse dans la voie de gel qui contient un contrôle PCR négatif indiquerait également une défaillance, car il serait risqué de supposer que la contamination ayant une incidence sur le ou les témoins négatifs n’a pas affecté les échantillons.
Pour le 16S et la métatranscriptomique, le succès du séquençage peut être évalué en regardant le nombre de séquences obtenues (Figure 2). Les échantillons 16S doivent avoir un minimum de 1 000 séquences, avec au moins 5 000 étant idéales(Figure 2A). De même, les échantillons métatranscriptomiques doivent avoir un minimum de 500 000 séquences, avec au moins 2 000 000 d’idéal(Figure 2B). Les échantillons avec moins de séquences que ces minimums ne doivent pas être utilisés pour les analyses, car ils peuvent ne pas représenter avec précision leur communauté bactérienne. Cependant, les échantillons qui se situent entre le minimum et l’idéal peuvent toujours être utilisés, bien que les résultats doivent être interprétés avec plus de prudence si de nombreux échantillons se situent dans cette fourchette.
Le succès de l’analyse ultérieure en aval peut être déterminé simplement sur la base de l’obtention ou non des fichiers de sortie attendus. Quoi qu’il en soit, les programmes, tels que QIIME2 et R(figure 3),devraient permettre d’évaluer les différences significatives potentielles entre les communautés bactériennes en fonction de la fracturation hydraulique. Les données de la figure 3 ont été obtenues en recueillant des échantillons de sédiments de vingt et un sites différents dans treize cours d’eau différents pour l’analyse 16S et métatranscriptomique. Sur ces vingt et un sites, douze d’entre eux étaient en aval de l’activité de fracturation et classés comme HF+, et neuf d’entre eux étaient soit en amont de l’activité de fracturation, soit dans un bassin versant où la fracturation hydraulique n’avait pas lieu; ces cours d’eau ont été classés comme HF-. Outre la présence d’activités de fracturation, les cours d’eau étaient par ailleurs comparables.
Ces différences pourraient prendre la forme de changements de composition cohérents basés sur l’état de la fracturation hydraulique. Si tel était le cas, on s’attendrait à ce que les échantillons HF+ et HF- se regroupent les uns des autres dans un diagramme PCoA, comme c’est le cas dans les figures 3A et 3B. Pour confirmer que ces changements apparents ne sont pas seulement un artefact de la méthode d’ordination, une analyse statistique plus approfondie est nécessaire. Par exemple, un test PERMANOVA22 sur la matrice de distance sur laquelle sont basées les figures 3A et 3B a révélé un regroupement significatif basé sur l’état de fracturation, ce qui signifie que la séparation observée dans le graphique est cohérente avec les différences entre les communautés bactériennes des échantillons, au lieu d’un artefact d’ordination. Un résultat significatif de PERMANOVA ou d’ANOSIM est une forte indication de différences constantes entre les échantillons HF+ et HF-, ce qui indiquerait que les échantillons HF+ ont été touchés par la fracturation hydraulique, tandis qu’une valeur p élevée indiquerait que les échantillons n’ont pas été touchés. Les données métatranscriptomiques peuvent également être visualisées et évaluées à l’aide des mêmes méthodes.
L’examen des caractéristiques différentielles (microbes ou fonctions) peut révéler des preuves que des échantillons ont également été touchés. Une méthode pour déterminer les entités différentielles consiste à créer un modèle de forêt aléatoire. Le modèle de forêt aléatoire peut être utilisé pour voir dans quelle mesure l’état de fracturation des échantillons peut être correctement classé. Si le modèle fonctionne mieux que prévu par hasard, ce serait une preuve supplémentaire des différences en fonction de l’état de la fracturation. De plus, les prédicteurs les plus importants révéleraient quelles caractéristiques étaient les plus importantes pour différencier correctement les échantillons(figure 3C). Ces caractéristiques auraient également eu des valeurs constamment différentes en fonction de l’état de la fracturation hydraulique. Une fois ces caractéristiques différentielles déterminées, la littérature peut être examinée pour voir si elles ont déjà été associées à la fracturation hydraulique. Cependant, il peut être difficile de trouver des études qui ont déterminé les fonctions différentielles, car la plupart n’ont utilisé que des données de composition de l’ARNr 16S. Par conséquent, pour évaluer les implications des fonctions différentielles, une méthode possible serait de voir si elles ont déjà été associées à une résistance potentielle aux biocides couramment utilisés dans les fluides de fracturation ou si elles pourraient aider à tolérer des conditions hautement salines. De plus, l’examen du profil fonctionnel d’un taxon d’intérêt pourrait révéler des preuves de l’impact de la fracturation hydraulique(figure 3D). Par exemple, si un taxon est identifié comme différentiel par le modèle forestier aléatoire, son profil de résistance aux antimicrobiens dans les échantillons HF+ pourrait être comparé à son profil dans les échantillons HF- et s’ils diffèrent considérablement, cela pourrait suggérer que le liquide de fracturation contenant des biocides est entré dans le flux.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>SampleID (ID de l’échantillon</td>
			<td>Concentration (ng/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0.745</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.805</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>7.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>0.053</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>0.248</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>0.945</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>1.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>0.804</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>0.551</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>1.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>4.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Below_Detection</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>7.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>0.346</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>2.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>1.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>0.951</td>
		</tr>
</tbody></table> Tableau 1 : Exemples de concentrations d’ADN basées sur le test de haute sensibilité de l’ADN Fluoromètre 1x DS. Les extractions pour tous ces échantillons, à l’exception de 14, seraient considérées comme réussies en raison de quantités détectables d’ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig01.jpg"> Figure 1: Exemple d’e-gel avec des produits PCR. Le gel a été pré-coloré et visualisé sous une lumière UV, faisant briller tout ADN présent sur lui. La PCR a fonctionné pour les échantillons des puits 4 et 6 de la première rangée, car ils avaient tous deux une seule bande lumineuse de la taille attendue (basée sur l’échelle). La PCR pour les échantillons des six autres puits a échoué, car ils n’ont produit aucune bande. Le témoin positif (premier puits, deuxième rangée) avait une bande brillante, ce qui indique que la PCR a été effectuée correctement, et les témoins négatifs (puits 6 et 7, deuxième rangée) n’avaient pas de bandes, ce qui indique que les échantillons n’étaient pas contaminés. Si un négatif avait une bande aussi brillante que les échantillons, la PCR aurait été considérée comme un échec car il serait risqué de supposer que les échantillons avaient des amplicons qui n’étaient pas seulement le résultat d’une contamination. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig02.jpg"> Figure 2: Exemples de comptages de séquences. (A) 16S exemples de séquences. Presque tous ces échantillons 16S avaient plus de 1 000 séquences. Les rares qui avaient moins de 1 000 séquences devraient être exclus des analyses en aval, car ils avaient des séquences insuffisantes pour représenter avec précision leurs communautés bactériennes. Plusieurs séquences avaient entre 1 000 et 5 000 séquences; Bien qu’ils ne soient pas idéaux, ils seraient toujours utilisables puisqu’ils dépassent le strict minimum, et la majorité des échantillons dépassent également le minimum idéal de 5 000. (B) L’exemple de métatranscriptomique compte. Tous les échantillons ont dépassé à la fois le nombre minimum (500 000) et le nombre minimum idéal (2 000 000) de séquences. Par conséquent, le séquençage a été un succès pour chacun d’entre eux, et ils ont tous pu être utilisés dans l’analyse en aval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig03.jpg"> Figure 3: Exemple d’analyse. (A) Diagramme PCoA basé sur des coordonnées calculées avec une matrice de distance unifrac pondérée créée et visualisée via QIIME2. (B) Diagramme PCoA basé sur les coordonnées calculées avec la matrice de distance unifrac pondérée exportée à partir de QIIME2. Les coordonnées ont été visualisées à l’aide des paquets Phyloseq et ggplot2 dans R. Les vecteurs de métadonnées ont été ajustés au tracé à l’aide du paquet Vegan. Chaque point représente la communauté bactérienne d’un échantillon, avec des points plus proches indiquant des compositions de communauté plus similaires. Un regroupement basé sur l’état de fracturation de ces échantillons de sédiments 16S a été observé (PERMANOVA, p = 0,001). En outre, les vecteurs révèlent que les échantillons HF + avaient tendance à avoir des niveaux plus élevés de baryum, de bromure, de nickel et de zinc, ce qui correspondait à une composition de communauté bactérienne différente par rapport aux échantillons HF-. (C) Graphique des meilleurs prédicteurs pour un modèle forestier aléatoire qui a testé où les abondances bactériennes pouvaient être utilisées pour prédire l’état de fracturation parmi les échantillons. Le modèle de forêt aléatoire a été créé via R à l’aide du package randomForest. Les 20 principaux prédicteurs sont présentés ainsi que les diminutions d’impuretés qui en résultent (mesure du nombre d’échantillons HF+ et HF- regroupés) sous la forme d’une diminution moyenne de l’indice de Gini lorsqu’ils sont utilisés pour séparer les échantillons. (D) Diagramme circulaire montrant le profil de résistance aux antimicrobiens du profil Burkholderiales basé sur des données métatranscriptomiques. Les séquences ont d’abord été annotées avec Kraken2 pour déterminer à quels taxons elles appartenaient. BLAST a ensuite été utilisé avec ces séquences annotées et la base de données MEGARes 2.0 pour déterminer quels gènes de résistance aux antimicrobiens (sous la forme de « MEG_# ») étaient activement exprimés. Les gènes de résistance aux antimicrobiens exprimés par les membres des Burkholderiales ont ensuite été extraits pour voir lesquels étaient les plus répandus parmi ces taxons. Bien que plus coûteuse et plus longue, la métatranscriptomique permet des analyses fonctionnelles, comme celle-ci, qui ne peut pas être effectuée avec des données 16S. Notamment, Kraken2 a été utilisé pour cet exemple d’analyse, au lieu de HUMAnN2. Kraken2 est plus rapide que HUMAnN2; cependant, il ne produit que des informations de composition, au lieu de la composition, de la contribution, des fonctions (gènes) et des voies comme le fait HUMAnN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire : Exemple de pipeline métatranscriptomique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/Supplemental%20File_61904_R2_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici un protocole pour étudier les impacts de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau voisins en analysant leurs communautés microbiennes d’eau et de sédiments.

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Ce protocole peut être utilisé pour répondre à la question de savoir si et comment la fracturation hydraulique affecte les bactéries dans les cours d’eau voisins et, par extension, les cours d’eau eux-mêmes. Le principal avantage de cette technique est sa nature holistique, car elle emmène le chercheur de la collecte d’échantillons jusqu’à l’analyse des données. Jeremy Chansee, bioinformaticien dans mon laboratoire, Sydney Regal, étudiant de premier cycle au Juniata College, et Gillian Leister, ma directrice de laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour prélever des échantillons de sédiments pour l’extraction des acides nucléiques, utilisez des gants pour immerger un tube conique stérile de 50 millilitres dans l’eau du ruisseau à partir du rivage. Pendant que le tube est immergé, retirez le bouchon et utilisez-le pour ramasser environ trois millilitres de sédiments d’une profondeur d’un à trois centimètres dans le tube. Après avoir prélevé l’échantillon, déversez la totalité sauf un millilitre d’eau du tube et utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter trois millilitres d’AGENT DE CONSERVATION DE L’ADN ET DE L’ARN à l’échantillon.Faire tourbillonner le tube conique bouché pendant cinq secondes pour bien mélanger l’agent de conservation et l’échantillon et stocker l’échantillon sur de la glace. À votre retour au laboratoire, conservez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse de l’ADN 16S ou à moins 70 degrés Celsius pour l’analyse de l’ARN métatranscriptomique. Pour la collecte du filtre, remplissez et videz complètement une bouteille stérile d’un litre entière avec de l’eau de flux trois fois pour conditionner la bouteille avant de la remplir une dernière fois.Sur une surface stable, aspirez un volume complet d’eau dans une seringue stérile à verrou luer et connectez la seringue à un filtre en polyéthersulfone stérile et sans ADN / ARN de 1,7 centimètre de diamètre avec une taille de pore de 0,22 micron. Rincez tout le volume d’eau du ruisseau à travers le filtre. Lorsque tout le volume de l’échantillon a été filtré de la même manière, aspirez environ 20 millilitres d’air dans la seringue et poussez l’air à travers le filtre pour éliminer tout excès d’eau du filtre.Ensuite, utilisez une micropipette P1000 pour ajouter deux millilitres de conservateur d’ADN / ARN à la plus grande ouverture du filtre tout en maintenant le filtre horizontalement avec l’extrémité de la pipette dans le barillet du filtre pour vous assurer que le conservateur pénètre dans le filtre. Ensuite, scellez le filtre avec des carrés de film de paraffine bien enroulés autour de chaque ouverture et placez le filtre dans un sac d’échantillon stérile sur de la glace. Au retour de l’échantillonnage, stockez les filtres pour 16S ou pour l’analyse métatranscriptomique comme démontré.Avant de commencer un transfert d’échantillon, nettoyez la zone de travail avec 10% d’eau de Javel et 70% d’éthanol. Pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’un échantillon de sédiments, utilisez un outil métallique stérilisé à la flamme et à l’éthanol pour transférer environ 250 milligrammes d’échantillon dans un tube de microcentrifugation. Pour l’extraction d’acide nucléique à partir d’un échantillon de filtre, utilisez une poignée d’étau stérilisée à 70 % d’éthanol et de flamme pour ouvrir le boîtier du filtre sur la surface stérile et retirer le noyau du boîtier.Utilisez un scalpel stérile pour trancher en haut, en bas et le long de la couture du noyau et utilisez une pince à épilester stérile pour plier le papier filtre avant de le couper en petits morceaux avec le scalpel. Ensuite, placez soigneusement les pièces filtrantes dans un tube de microcentrifugation sans entrer en contact avec des surfaces non stérilisées. Pour la lyse des cellules dans l’un ou l’autre type d’échantillon, soumettez le tube à un perturbateur cellulaire à grande vitesse.Après au moins cinq minutes, centrifuger les échantillons et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Ajouter un tampon de lyse au surnageant à un rapport de un pour un et transférer la solution dans le filtre fourni. Placez le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation et ajoutez 400 microlitres de tampon de préparation au tube.Après centrifugation, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage au tube et centrifugez à nouveau le filtre. Après avoir éliminé le débit, ajoutez 400 microlitres de tampon de lavage au tube pour une centrifugation supplémentaire et transférez le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile. Pour éluer l’ADN, traiter le filtre avec 50 microlitres d’eau sans DNase/RNase pendant cinq minutes à température ambiante.En attendant, placez un filtre à trois HRC dans un tube de collecte et ajoutez 600 microlitres de solution de préparation HRC. Après centrifugation, transférer le filtre dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile et transférer l’ADN élué au filtre pour la centrifugation. Le flux contient l’ADN extrait.Pour créer une bibliothèque d’ARN ADN 16S, utilisez d’abord le produit ADN fraîchement extrait pour l’amplification de l’ARN ribosomique 16S avec un protocole PCR standard. Mélanger sept microlitres du produit PCR résultant et 13 microlitres d’eau sans DNase et charger la solution PCR sur un gel d’agarose à 2%. Ensuite, faites fonctionner le gel à 90 volts pendant 60 à 90 minutes pour vérifier la taille d’une bande de 386 paires de bases comme preuve d’une amplification réussie.Pour purifier la bibliothèque d’ARN ribosomique DE l’ADN 16S, remettez en commun 10 microlitres des produits de PCR qui ont produit des bandes brillantes et 13 microlitres des échantillons qui ont donné des bandes faibles dans un tube de microcentrifugation stérile et chargez environ 150 à 200 nanogrammes de chaque échantillon regroupé dans des puits individuels d’un nouveau gel de 2%. Après avoir exécuté le gel comme démontré, éliminez les 386 bandes de paires de bases du gel et utilisez un kit commercial pour purifier l’ADN. Ensuite, éluez l’ADN purifié avec 30 microlitres de chlorhydrate de Tris de 10 millimolaires et emballez les bibliothèques purifiées dans de la glace carbonique avant de les expédier pour le séquençage de nouvelle génération.Dans cette analyse représentative, toutes les extractions, à l’exception d’une seule, seraient qualifiées de réussies. Les bandes lumineuses observées après l’amplification par PCR indiquent le succès du protocole 16S. Les échantillons 16S doivent avoir un minimum de 1 000 séquences avec au moins 5 000 étant idéales, tandis que les échantillons métatranscriptsomiques doivent avoir un minimum de 500 000 séquences avec au moins 2 millions étant idéales.Des échantillons de sédiments provenant de 21 sites différents dans 13 cours d’eau différents pour l’analyse 16S et métatranscriptomique sont montrés. Sur ces 21 sites, 12 étaient en aval de l’activité de fracturation et classés comme fracturation hydraulique positive, et neuf étaient soit en amont de l’activité de fracturation, soit dans un bassin versant dans lequel la fracturation hydraulique était absente et classés comme fracturation hydraulique négative. Tel qu’évalué par l’analyse PERMANOVA, la séparation observée entre les données positives et négatives de fracturation hydraulique suggère que les échantillons positifs de fracturation hydraulique ont été affectés par la fracturation hydraulique.Les prédicteurs de forêt aléatoires les plus importants révéleraient quelles caractéristiques étaient les plus essentielles pour différencier correctement les échantillons. Si un taxon est identifié comme important par le modèle forestier aléatoire, son profil de résistance aux antimicrobiens dans les échantillons positifs de fracturation hydraulique pourrait être comparé à son profil dans les échantillons négatifs de fracturation hydraulique. S’ils diffèrent considérablement, cela pourrait suggérer que le liquide de fracturation contenant des biocides est entré dans le flux.Les microbes sont partout, de sorte que la contamination est un problème potentiel important avec ce type de travail. Les étapes initiales de transfert d’échantillon sont particulièrement sujettes à cela. Si l’on s’intéresse à la biodégradation microbienne ou à d’autres métabolismes, le séquençage de l’ARN peut être utilisé pour étudier l’expression génique microbienne active.Cette technique permet la standardisation des techniques moléculaires pour l’étude des communautés bactériennes in situ, ainsi que des analyses bioinformatiques des données de séquences bactériennes.

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