La nouvelle génération de séquençage de l'ARN ribosomal 16S gènes amplicons

L’objectif global de cette procédure est de séquencer 16 S-R-R-N-A. Gènes amplifiés à partir d’échantillons environnementaux à l’aide d’une machine de séquençage de paillasse. Ceci est accompli en amplifiant d’abord le gène 16 S-R-R-N-A à l’aide d’amorces modifiées.

La deuxième étape consiste à purifier les produits d’amplification, à les quantifier et à les regrouper. Ensuite, le pool d’amplicon est attaché à des sphères de séquençage amplifiées clonalement lors de la PCR d’émulsion et séquencées sur un séquenceur de paillasse. La dernière étape consiste à analyser les ensembles de données de séquence résultants.

En fin de compte, 16 S-R-R-N-A. Le séquençage d’amplicon génétique est utilisé pour déterminer la composition et la diversité de la communauté microbienne dans un échantillon environnemental. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la DGG ou le séquençage par clonage, est qu’elle donne une perspective plus profonde et plus claire de la composition et de la diversité des communautés microbiennes.

Cette méthode peut vous aider à répondre à l’une des questions clés de l’écologie microbienne : qui est là pour commencer les amorces avant et arrière ? Les deux X hot start tac plus master mix et les échantillons, la séquence des amorces avant et arrière correspondent au modèle présenté. La séquence contient des adaptateurs spécifiques aux torrents ioniques.

Une clé de séquençage pour calibrer l’intensité du signal au début du séquençage. Exécutez une amorce spécifique au modèle et un code-barres de 10 paires de bases. Ensuite, mélangez soigneusement les amorces et les échantillons avant utilisation.

Préparez une réaction PCR. Mélangez 20 microlitres par réaction contenant 0,5 micromolaire de l’amorce inverse, 0,4 milligramme par millilitre de BSA et un mélange principal X hot start tac plus. Ensuite, pipetez 18,5 microlitres du mélange principal dans chaque tube PCR, ajoutez 0,5 microlitre d’une solution mère d’amorce directe de 20 millimolaires contenant un code-barres différent à chacun des échantillons qui seront séquencés ensemble.

Ensuite, à l’extérieur du capot PCR, ajoutez un microlitre d’un échantillon à une concentration de un à 10 nanogrammes par microlitre dans le tube PCR. Réglez un programme avec une dénaturation initiale de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis 25 cycles à 95 degrés Celsius pendant 30 secondes.

55 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 45 secondes. L’élongation finale doit être de 72 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez les tubes dans une machine PCR et démarrez le programme.

Les produits PCR finaux peuvent être placés à quatre degrés Celsius ou moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Préparez un gel à 2 % d’aros à l’aide des plus grands peignes disponibles. Ensuite, mélangez cinq microlitres de six colorants de chargement de gel avec chaque réaction PCR et chargez les échantillons sur le gel en séparant chaque échantillon par un vide.

Eh bien, faites fonctionner le gel à 70 volts pendant 50 minutes. Une fois le gel écoulé, prenez une photo du gel et coupez les bandes à l’aide d’un scalpel. Chaque bande devrait comporter environ 250 paires de bases, ce qui contient un produit de 190 paires de bases avec 63 paires de bases qui composent les adaptateurs et les codes-barres.

Ensuite, pesez les bandes excisées et procédez à l’extraction du gel et à la purification des produits PCR. À l’aide d’un kit tel que le kit d’extraction rapide de gel kayak, quantifiez ensuite chaque produit PCR avec du vert pico et faites des dilutions pour obtenir une solution mère à cinq fois 10 à la neuvième molécules par microlitre, soit environ un nanogramme par microlitre. Si certains échantillons présentent une amplification plus faible, ajustez la concentration si nécessaire, mais ne descendez pas en dessous de 1,57 fois 10 à la septième molécule par microlitre.

Regrouper 10 microlitres de chaque produit PCR dilué pour obtenir un pool molaire égal d’échantillons, préparer un pool distinct pour chacun des cycles de séquençage prévus. Les produits PCR groupés peuvent être conservés au congélateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour réaliser une émulsion. PCR Tout d’abord, diluez les produits de PCR groupés à 26 picaMolar dans un volume de 25 microlitres et séparez les réactifs d’un kit de matrice ionique PGM.

Travaillez ensuite dans une hotte PCR et préparez l’émulsion PCR. Mélangez les produits PCR regroupés et les particules sphériques peuvent être ajoutées lors du travail sur la paillasse. Mélangez soigneusement la solution, puis insérez le mélange dans une cartouche filtrante et recouvrez soigneusement d’huile d’émulsion.

Ensuite, retournez lentement la cartouche filtrante et chargez la cartouche sur l’appareil PCR d’émulsion automatisé. Sélectionnez ensuite le programme approprié et lancez la procédure. Une fois la PCR d’émulsion automatisée terminée, retirez le surnageant des tubes de collecte et récupérez les particules sphériques au fond des tubes. Resus.

Suspendez les sphères dans 100 microlitres de solution de lavage et prélevez une aliquote de deux microlitres pour la quantification en bibliothèque. Pour séquencer les produits de PCR, préparez un plan d’exécution de séquençage qui spécifie les détails de l’exécution de séquençage. Ouvrez ensuite l’instrument, cliquez sur initialiser et, lorsque vous y êtes invité, installez la solution de lavage numéro deux, la solution de lavage numéro un et la solution tampon de pH automatique dans l’instrument de séquençage.

Ensuite, poursuivez la procédure d’initialisation et, lorsque vous y êtes invité, ajoutez les nucléotides D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P et DTTP dans leurs tubes respectifs de 50 millilitres. Vissez ensuite les tubes sur la machine de séquençage et poursuivez la procédure d’initialisation. Une fois la procédure d’initialisation terminée, lancez immédiatement la procédure de chargement des échantillons pour préparer les échantillons pour le séquençage.

Centrifugez les sphères enrichies de l’émulsion PCR à 15 500 fois G pendant 1,5 minute pour recueillir les sphères au fond du tube. Retirez ensuite le S natin et laissez exactement trois microlitres dans le tube. Ensuite, ajoutez trois microlitres d’amorce de séquençage dans le tube et pipetez de haut en bas pour remettre les particules en suspension et bien mélanger la solution.

Incuber le tube pendant deux minutes à 95 degrés Celsius, puis pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque l’incubation est terminée, ajoutez un microlitre de polymérase et mélangez bien puis incubez le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant que le mélange est en incubation, chargez la puce de séquençage sur le séquenceur et effectuez un contrôle de qualité de la puce.

Retirez ensuite le liquide de la puce à l’aide d’une centrifugation rapide et d’une micro-centrifugeuse. Chargez l’échantillon dans la puce en pipetant lentement sept microlitres du mélange de sphères enzymatiques et en évitant d’introduire des bulles dans la puce. Une fois l’échantillon chargé dans la puce, placez-la dans l’instrument et lancez le séquençage.

Pour commencer l’analyse des données, connectez-vous au serveur de données de séquençage et téléchargez le fichier Q rapide. Créez ensuite un fichier d’oligos délimité contenant l’amorce et les informations du code-barres. Ensuite, téléchargez les fichiers de référence Green Genes à partir du site Web de la mère, lancez la mère et effectuez l’analyse.

Convertissez les fichiers FASTQ en un fichier de qualité rapide à l’aide de la commande affichée en bas de l’écran. Déterminez l’appartenance au groupe de chaque séquence et coupez les séquences. À l’aide de cette commande, classez ensuite les séquences dans la taxonomie des gènes verts.

En utilisant cette commande, la production moyenne lors du séquençage à l’aide d’un vaisseau de trois 14 sur un PGM de torrent ionique est d’environ 0,3 à 0,5 million. Lectures de bonne qualité après filtrage des résultats dans la mère. Voici une répartition typique du nombre de lectures après chaque étape de cette procédure de séquençage de nouvelle génération : voici la composition moyenne de la communauté au niveau de la classe de phylum des 36 échantillons environnementaux multiplexés qui ont été amplifiés avec des amorces ciblant la région V trois à quatre du ribosome 16 s et analysés à l’aide du maître mère One.

Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de séquencer les candidats à l’ARN ribosomique 16 s à l’aide d’une machine de séquençage de paillasse.