Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des sciences de l’environnement, telles que les impacts de la pollution chimique ou le changement climatique dans les écosystèmes aquatiques. Le principal avantage de cette technique est que toutes les étapes individuelles sont simples et rapides à réaliser. Bien que l’objectif de la procédure soit de caractériser les biofilms autotrophes, elle peut également être utilisée pour caractériser les biofilms hétérotrophes et détecter les particules polluantes telles que les microplastiques.

Pour commencer, choisissez un site d’échantillonnage aquatique où le biofilm se développe, ce sont généralement des parties peu profondes des cours d’eau qui ont un débit d’eau lent à intermédiaire et des lits de cours d’eau caillouteux. Si le site n’a pas assez de surface pour la fixation du biofilm, vous pouvez utiliser des substrats artificiels sur lesquels les biofilms peuvent se développer. Mesurez les conditions environnementales sur le site d’échantillonnage à l’aide d’instruments portables pour mesurer la conductivité, le pH, la température de l’eau et l’intensité lumineuse juste au-dessus de la surface du biofilm à échantillonner.

À l’aide de gants de protection, ramassez des pierres de taille, de forme et de type similaires sur chaque site. Les pierres doivent être collectées dans des zones exposées à des conditions d’écoulement et de lumière similaires. En plus de la collecte d’échantillons de biofilm et de la mesure des conditions de croissance sur place, prélevez des échantillons d’eau pour mesurer les paramètres chimiques de l’eau.

Pour traiter les échantillons de biofilm, filtrez d’abord 15 millilitres d’eau de ruisseau du site à travers un filtre de 0,22 micromètre. Ensuite, utilisez une brosse à dents souple pour retirer le biofilm du substrat jusqu’à ce qu’il soit complètement suspendu dans un flacon. Fixez les échantillons de biofilm à l’aide de 0,01 % de paraformaldéhyde et de 0,1 % de glutaraldéhyde.

Transférez des sous-échantillons du biofilm dans un microscope optique. Tournez-vous vers le grossissement approprié pour votre échantillon et identifiez les espèces présentes dans les échantillons de biofilm. Préparez les cultures pour chaque espèce.

Cultivez-les en continu en utilisant des conditions environnementales similaires à celles de l’environnement dans lequel les échantillons de biofilm ont été prélevés. Une fois cultivées, dispersez les cellules en les sonisant pendant cinq à 10 secondes à 45 kilohertz. Placez les cellules dispersées dans une plaque à 96 puits.

Une fois dispersés, enregistrez les spectres d’absorbance et de fluorescence de l’espèce unique à l’aide d’un lecteur de plaques. Ensuite, installez le cytomètre en flux avec des séparateurs et des filtres dichroïques pour couvrir les gammes fluorescentes dans lesquelles les différentes espèces ont des propriétés spécifiques. Pour préparer une référence monospécifique, utilisez les paramètres optimisés de cytométrie en flux pour mesurer les propriétés optiques et fluorescentes d’une seule espèce.

Ensuite, préparez les cellules endommagées et en décomposition en prélevant un sous-échantillon d’un millilitre de biofilm dilué, en le centrifugeant à 8 000 g pendant 10 minutes, puis en remettant le granulé en suspension dans un millilitre d’éthanol à 90 %. Conservez la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius et répétez le processus le lendemain. À l’aide des mêmes paramètres de cytométrie en flux optimisés, mesurez les propriétés optiques et fluorescentes des cellules endommagées et en décomposition.

Après avoir défini les paramètres du cytomètre en flux et construit la base de données de référence, il est temps de commencer à collecter des échantillons pour la campagne de surveillance. Les échantillons doivent être prélevés et traités comme indiqué dans les étapes précédentes, à l’exception du fait que la sonication doit prendre une minute à 45 kilohertz. Une fois prêt à analyser, prélevez les échantillons de l’entrepôt.

Pour éviter de bloquer le cytomètre en flux, filtrez les sous-échantillons à l’aide de filtres interstitiels de 50 micromètres, puis chargez un à deux millilitres des échantillons individuels dans le cytomètre en flux et mesurez les propriétés optiques et fluorescentes de chaque particule. Répétez la mesure trois fois pour chaque échantillon. Ouvrez MATLAB et exécutez CYT comme une boîte à outils.

Ensuite, importez les données de cytométrie à flux réduit sous forme de fichier csv dans le logiciel CYT. Ensuite, utilisez la transformation arcsinus hyperbolique pour transformer les canaux fluorescents de tous les échantillons. Entrez 150 comme valeur du cofacteur.

Cette valeur fonctionne pour la plupart des biofilms phototrophes et des cytomètres en flux, mais une optimisation peut être nécessaire. Pour le contrôle de la qualité, tracez et comparez visuellement les histogrammes des échantillons individuels et des canaux optiques et fluorescents individuels pour vous assurer qu’il n’y a pas de valeurs aberrantes au niveau technique et biologique de la réplication. Les valeurs aberrantes se manifesteront par des distributions optiques fluorescentes significativement décalées entre les réplicats.

Ensuite, fusionnez les réplicats techniques dans chaque réplication biologique et sous-échantillonnez les réplicats biologiques de sorte que chacun soit représenté par le même nombre de particules. Le nombre idéal de particules analysées par Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding est d’environ 150 000. Pour la comparaison entre les échantillons, sélectionnez uniquement les échantillons à comparer et exécutez Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding.

Une fois l’algorithme terminé, de nouvelles voies, nommées bh-SNE1 et bh-SNE2, apparaissent. Visualisez les données des canaux résultants sous la forme d’un nuage de points pour afficher toutes les coordonnées d’incorporation de voisins stochastiques contenant toutes les particules analysées. Si les amas ne sont pas séparables visuellement, il est probable que l’analyse ait été utilisée en trop ou pas assez.

Ajustez le nombre de particules et répétez l’analyse. Dans la carte viSNE, les particules sont positionnées en fonction de leur similitude et regroupées en grappes visuellement séparables. Inspectez les propriétés de fluorescence optique des grappes et marquez et nommez celles qui sont bien séparées et ont des propriétés différentes à l’aide des outils de dessin.

Pour une analyse statistique ultérieure, exportez les clusters viSNE dans MATLAB. À l’aide de la procédure présentée ici, des échantillons prélevés sur plusieurs sites d’un cours d’eau local en Suisse ont été analysés. À l’aide des cartes viSNE, il est possible de distinguer différents biofilms environnementaux.

Ici, six échantillons différents présentent des densités différentes dans différentes parties de la carte viSNE. Les cartes viSNE présentées ici sont peuplées de particules ayant différentes propriétés optiques et de fluorescence qui donnent des indices sur l’origine biotique/abiotique des particules et sur le groupe taxonomique auquel les particules biotiques appartiennent. De plus, la projection de la base de données de référence sur la carte viSNE peut aider à interpréter quelles parties de la carte sont peuplées par quels taxons et/ou particules abiotiques.

Il peut également établir quelles sous-populations sont différentes entre les échantillons. Ici, le nombre de particules pour chaque sous-population est indiqué pour chacune des différentes réplicats biologiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures entre le prélèvement de l’échantillon et l’analyse finale.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le tri cellulaire activé par fluorescence peuvent être utilisées pour valider les prédictions du clustering visuel. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la cytométrie en flux et le regroupement visuel pour analyser les biofilms aquatiques.