Isolement et imagerie vivants, régions intactes du stimulateur cardiaque du bassinetet du rein de souris par section vibratome

L’objectif de ce protocole est d’isoler les régions intactes du stimulateur cardiaque du bassinet du rein de la souris à l’aide d’une section vibratome. Ces sections peuvent ensuite être utilisées pour l’imagerie in situ du Ca²⁺ afin d’élucider les propriétés transitoires du Ca²⁺ des cellules du stimulateur cardiaque et d’autres cellules interstitielles dans des tranches de vibratome.

Ce protocole donne des régions intactes du stimulateur cardiaque du bassinet du rein, l’organe musculaire lisse dans le rein qui pompe l’urine dans l’uretère et dans la vessie. Contrairement à l’isolement des cellules du bassinet du rein, cette approche fournit des environnements in situ intacts des régions du stimulateur cardiaque du bassinet du rein et une préparation plus physiologique pour l’étude du rythme du bassinet du rein. Une personne qui n’a jamais pratiqué cette technique peut avoir du mal à couper des sections uniformes.

Un nouvel utilisateur doit s’assurer que le rein est au niveau du vibratome et n’accélère pas le processus de coupe. À l’aide de pinces tissulaires internes et de ciseaux à dissection interne, pincez les intestins et éloignez-les de la paroi abdominale. Couper simultanément le dessous des intestins libres du corps au niveau du duodénum proximal et du côlon distal pour accéder à l’espace rétropéritonéal contenant les reins.

Pincez doucement et soulevez l’extrémité distale de l’uretère avec une pince à tissu. À l’aide des ciseaux à dissection, coupez sous l’uretère pincé vers le rein jusqu’à ce qu’il soit libéré du tissu conjonctif environnant. Une fois les reins exposés, extrayez-les individuellement.

Remplissez un plat recouvert d’élastomère de silicium avec une solution KRB glacée. Transférer le rein dans la boîte de dissection et s’assurer qu’il est complètement immergé. Utilisez des ciseaux à ressort fins et une pince interne pour enlever le tissu adipeux de la base du rein afin d’exposer le bassinet rénal distal, ou RP, et l’uretère proximal.

Retirez l’uretère proximal et une partie du RP distal de la base à l’aide de ciseaux à ressort fin et de pinces. Percez la capsule rénale externe avec une pince à pointe fine, en écartant les extrémités du corps rénal. À l’aide de pinces avec chaque main, pincez les extrémités lâches de la capsule et pelez-les jusqu’à ce que la membrane restante de la capsule rénale soit entièrement enlevée.

Insérez une lame de rasoir dans le support de lame de l’instrument vibratome et ajustez l’angle de jeu de la lame à environ 18 degrés. Ajustez les paramètres de la lame comme mentionné dans le manuscrit du texte, en vous assurant que l’épaisseur de la section rénale ne dépasse pas 150 micromètres, ce qui aurait un impact négatif sur les expériences d’imagerie par ions calcium. Utilisez des pinces émoussées pour saisir doucement et retirer le rein préparé de la solution de KRB glacée.

Placez immédiatement le rein sur du papier absorbant pendant environ deux à quatre secondes pour éliminer l’excès d’humidité externe. Rouler doucement le rein sur le papier absorbant pour s’assurer que tous les côtés du parenchyme ont séché afin qu’il y ait une adhérence optimale du rein au stade vibratome. Appliquez immédiatement une fine couche de colle cyanoacrylate sur la base de la plaque d’échantillon de vibratome et utilisez une pince à extrémité émoussée pour placer l’uretère rénal vers le bas sur la zone recouverte de colle.

Appliquez doucement une pression vers le bas sur le dessus du rein avec le bord plat de la pince pendant environ 10 à 20 secondes pour sécher la colle. Fixez fermement la plaque d’échantillon au bas du plateau tampon et ajustez le niveau de solution de KRB de sorte que le haut du rein soit complètement immergé. Pour la section automatique du vibratome, sélectionnez les positions de début et d’extrémité du cycle de coupe de la lame du vibratome à 0,5 à 1 centimètre du rein pour vous assurer que tout le plan rénal est sectionné.

Démarrez le processus de coupe automatique, en vous assurant que la lame entre en contact avec le rein. À l’aide de pinces, collectez les sections libérées du rein et transférez-les immédiatement dans des puits individuels. Poursuivez le protocole de sectionnement et utilisez un microscope optique pour identifier les régions PKJ dans les tranches rénales jusqu’à ce que les régions PKJ deviennent plus apparentes.

Remplissez une boîte d’imagerie recouverte d’élastomère de silicium avec une solution KRB glacée. Transférer une tranche de rein individuelle dans le plat. Insérez des broches Minutien autour de la périphérie d’une tranche de rein pour fixer la section à la base de la boîte d’imagerie.

Placez la boîte d’imagerie sur la scène d’un microscope confocal à disque tournant droit et commencez immédiatement à infuser avec une solution KRB. Utilisez une lentille d’objectif à immersion dans l’eau à faible grossissement pour localiser la tranche de rein. Centrez le champ d’imagerie sur les zones de la tranche où le PKJ est présent à l’aide de repères.

Une fois le PKJ localisé, utilisez une lentille d’objectif à immersion dans l’eau à grossissement plus élevé pour agrandir la zone d’intérêt. Distinguer différentes cellules d’intérêt dans différents types de durées transitoires d’ions calcium dans la paroi PKJ. Une fois que les cellules d’intérêt ont été identifiées, ajustez l’intensité du laser pour obtenir un bon rapport signal/bruit et enregistrez des images à une fréquence d’échantillonnage temporelle comprise entre 16 et 32 Hertz.

Des images microscopiques lumineuses de sections entières de reins montrent des repères annotés d’une seule région PKJ. Plusieurs régions PKJ se présentent à proximité de la moelle épinière interne et du rein distal. Les emplacements des artères rénales PKJ et les limites PKJ sont indiqués ici.

Une section PKJ d’une souris exprimant GCaMP dans les cellules alpha positives PDGFR est montrée ici. La fine paroi PKJ suspendue entre le tissu parenchymateux peut être distinguée à l’aide de repères tels que l’artériole rénale. L’expression de GCaMP6f dans ce tissu transgénique spécifique est répartie sur toute la largeur de la PKJ à travers les couches musculaires et adventitielles.

Dans les tranches rénales positives PDGFR alpha GCaMP6f, un réseau de cellules qui s’étend généralement sur la largeur de la paroi PKJ est fluorescent et affiche des transitoires d’ions calcium oscillants de différentes durées et fréquences. Dans les tranches rénales positives SMC GCaMP3, une couche de cellules GCaMP3 positives est présente dans la couche musculaire. Une carte spatio-temporelle montre que les cellules alpha positives PDGFR situées dans l’adventitie PKJ provoquent des transitoires d’ions calcium à basse fréquence de longue durée, tandis que les SMC ont déclenché plus fréquemment des transitoires d’ions calcium de plus courte durée.

De même, un réseau de signaux d’ions calcium fluorescents à l’intérieur et autour des conduits collecteurs et des transitoires d’ions calcium oscillants dans les SMA a également été observé. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important que le rein soit aussi plat que possible pendant la section du vibratome pour s’assurer que des tranches de rein uniformes sont libérées du bloc. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’isolement unicellulaire, l’immunohistochimie et les études moléculaires peuvent être effectuées pour améliorer notre compréhension des mécanismes des stimulateurs cardiaques dans le bassinet du rein.