Name: Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse d'images automatisée pour quantifier les neurones dopaminergiques dans la substantia nigra chez le rat. Cette technique rapide et fiable offre une alternative efficace à la stéréologie traditionnelle pour la recherche sur la maladie de Parkinson.

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Les auteurs tiennent à remercier tout le personnel de l’Installation avancée de microscopie optique (AOMF) du Réseau universitaire de santé pour leur temps et leur aide dans l’élaboration de ce protocole.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux du Réseau universitaire de santé et exécutées conformément aux lignes directrices et aux règlements établis par le Conseil canadien de protection des animaux.
1. Injection stéréotaxique
<ol><li>Couples de rats Sprague-Dawley femelles adultes (250-280 g) dans des cages avec litière en bois et accès ad lib à la nourriture et à l’eau. Maintenir la colonie animale dans un cycle clair/sombre régulier de 12 h (lumières à 06h30) avec une température et une humidité constantes.</li>
	<li>Effectuer une injection stéréotaxique unilatérale d’AAV directement au SNpc sur le côté droit du cerveau (côté droit ou gauche, selon les préférences de chaque laboratoire) comme décrit précédemment8,10. Injecter 2 μL d’AAV1/2 à un titre final de 3,4 x 1012 particules génomiques/mL.</li>
</ol>2. Sectionnement cérébral et immunohistochimie (CSI)
<ol><li>Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane en le plaçant dans une chambre anesthésiante pendant 3 min. D’autres méthodes approuvées peuvent être utilisées pour cette étape après un examen institutionnel approprié.</li>
	<li>Une fois que le rat a atteint un plan chirurgical d’anesthésie profonde, transférez-le dans un cône de nez fermement fixé à une table d’autopsie. Fixez les pattes antérieures du rat à l’aide de ruban adhésif et utilisez la méthode de réponse au pincement des pincements pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. L’animal doit ne pas répondre avant de continuer.</li>
	<li>Faites une incision latérale sous le sternum et coupez à travers le diaphragme sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale. Soulevez et serrez le sternum avec un hémostatique et placez-le au-dessus de la tête.</li>
	<li>Serrez le cœur à l’aide d’une pince et insérez une aiguille papillon reliée à une pompe de perfusion dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche. Perfuser le rat transcardialement avec 150 ml de solution saline héparinisée, ou jusqu’à ce que les yeux et la peau soient clairs. La perfusion avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA), au lieu d’une solution saline, peut être préférée pour faciliter l’immunomarquage avec certains anticorps ou une section plus mince du cerveau.</li>
	<li>Une fois la perfusion terminée, décapiter avec une guillotine et extraire le cerveau vers une matrice cérébrale, surface ventrale tournée vers le haut.</li>
	<li>À l’aide d’une lame de rasoir fraîche, faire une coupe dans le plan coronal 2 mm rostral au chiasme optique. Faites glisser la lame d’un côté à l’autre pour éviter de déformer le cerveau tout en tranchant.</li>
	<li>Immerger la partie postérieure du cerveau dans un flacon pré-marqué contenant environ 20 mL de PFA à 4% pendant 48 h de post-fixation à température ambiante. La partie antérieure du cerveau peut être congelée instantanément dans du 2-méthylbutane réfrigéré à -42 °C avant d’être entreposée à -80 °C.</li>
	<li>Après 48 h, transférer les cerveaux fixes dans un flacon marqué contenant 30% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’ils coulent (48-72 h).</li>
	<li>Préparer un microtome en plaçant de la glace carbonique dans l’auge de l’échantillon, suivie d’éthanol à 100 %. Une fois l’étape refroidie, pressez le composé de température de coupe optimale (OCT) sur l’étape jusqu’à ce qu’il forme un cercle de 2 cm de diamètre et de 0,5 cm d’épaisseur. Une fois partiellement gelé, abaissez soigneusement le cerveau sur le monticule d’OCT, en veillant à ce que la surface de coupe striatale reste parallèle au stade.</li>
	<li>Ajoutez plus de glace carbonique à la scène pour aider le cerveau à geler. Une fois que le cerveau a pris une couleur crème, effacez le stade de la glace carbonique.</li>
	<li>Percez un trou dans le côté droit du cerveau avec une aiguille 25G pour distinguer les hémisphères droit et gauche. Veillez à ne pas passer l’aiguille à travers les structures anatomiques d’intérêt.</li>
	<li>Couper en série des sections de 40 μm dans le plan coronal commençant à bregma -3,8 et se terminant à bregma -6,8.</li>
	<li>Conservez six séries dans des tubes étiquetés avec une solution antigel (40% PBS, 30% 2-éthoxyéthanol, 30% glycérol). Chaque série doit contenir 12 sections du cerveau.</li>
	<li>Sélectionnez un ensemble de sections pour la coloration immunohistochimique et lavez la solution antigel avec 3 x 10 lavages de minute dans 0,2% PBS-T.</li>
	<li>Bloquer pendant 1 h à droite avec nutation douce en solution de blocage (10% sérum de chèvre normal (NGS), 2% d’albumine sérique bovine (BSA) dans 0,2% PBS-T). Suivez ceci avec l’incubation avec l’anticorps anti-tyrosine hydroxylase de lapin (TH) (1:500) et l’anticorps anti-α-syn de souris (1:500) dans 2% NGS dans 0.2% PBS-T pendant la nuit à température ambiante.</li>
	<li>Laver l’anticorps primaire avec 3 x 5 lavages de minute dans 0,2% PBS-T, suivi d’une incubation de 1 h avec l’anticorps secondaire alexa fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:500) et l’anticorps secondaire alexa fluor 555 anti-souris de chèvre dans 2% NGS dans 0,2% PBS-T. Assurez-vous que les sections sont protégées de la lumière et des noisettes doucement.</li>
	<li>Lavez les anticorps secondaires avec des lavages de 3 x 5 minutes dans 0,2% PBS-T et montez l’ensemble complet des sections sur des lames protégées de la lumière et de la poussière à l’aide d’un pinceau étroit. Lamelle de couverture avec support de montage de fluorescence et joint avec vernis à ongles transparent.</li>
</ol>3. Microscopie confocale et acquisition d’images
<ol><li>Capturez des images IHC à l’aide d’un logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10x. Ouvrez le trou d’épingle à 1,5 UA pour capturer un plan large totalisant ~ 1,5 μm et ouvrez la mise au point sur le côté injecté du cerveau.</li>
	<li>Sous l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie Tile Scan (Analyse par vignettes) et définissez les dimensions sur 10 x 4.</li>
	<li>Sous le panneau Mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1. Cela permet d’éviter les marques d’assemblage évidentes entre les images de numérisation de tuiles.</li>
	<li>Définissez la taille d’image sur 1024 x 1024 pixels et la moyenne sur 2 pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.</li>
	<li>Dans le panneau Canaux, définissez la piste 1 sur Alexa488 et la piste 2 sur Alexa555.</li>
	<li>Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez sur Live dans le panneau Acquisition.</li>
	<li>Dans le panneau Canaux, définissez la force et le gain laser sur des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de l’arrière-plan. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés (comme indiqué par une superposition rouge foncé).</li>
	<li>Répétez l’étape ci-dessus avec plusieurs diapositives pour vous assurer que la coloration est cohérente entre les diapositives, car la force / le gain du laser ne peut pas être ajusté entre les diapositives.</li>
	<li>Sous l’onglet Acquisition, cochez la case Positions. </li>
	<li>À ce stade, vous êtes prêt à commencer l’imagerie. À l’aide de l’oculaire, choisissez la première section montrant une coloration TH positive, définissez la mise au point au point d’intérêt (c.-à-d. SNpc), puis déplacez la scène vers la ligne médiane de la section. Cela enregistre la position dans les axes x, y et z et image une analyse de tuiles capturant toute la section.</li>
	<li>Répétez l’étape ci-dessus pour toutes les sections du SNpc en donnant un ensemble complet d’images du SNpc. Si une analyse détaillée du côté non injecté est requise, les étapes 3.10 à 3.11 doivent être répétées en mettant l’accent sur le côté non injecté.</li>
</ol>4. Analyse et quantification d’images
<ol><li>Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez les fichiers image dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.</li>
	<li>Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation Plume pour dessiner une annotation autour du SNpc. REMARQUE: Dans les sections qui ont une grande quantité de perte de neurone dopaminergique, l’augmentation temporaire de l’émétence / absorption peut aider à définir clairement le SNpc (Figure 2).</li>
	<li>Passez à l’onglet Analyse et dans le menu déroulant Analyser, sélectionnez Réglage en temps réel. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant la modification en temps réel des paramètres d’analyse(Figure 3).</li>
	<li>Sous la section Agrandissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié.</li>
	<li>Dans la section Détection cellulaire, sélectionnez colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH (Alexa Fluor 488).</li>
	<li>Ajustez les paramètres Seuil de contraste nucléaire, Intensité nucléaire minimale, Agressivitéde la segmentation nucléaire et Taille nucléaire tout en regardant attentivement la fenêtre réglage en temps réel. Remarque : représentation précise de chaque cellule individuelle comme une seule cellule dans la fenêtre de réglage en temps réel est essentielle pour la précision. Ces paramètres sont à une échelle arbitraire en fonction du logiciel utilisé, mais un ajustement correct est nécessaire pour permettre au logiciel de différencier avec précision les cellules individuelles et entre les cellules et l’arrière-plan (Figure 3).</li>
	<li>Répétez ce processus avec un minimum de 10 échantillons distincts pour assurer un accord uniforme de ce qui constitue une cellule à travers différentes sections. Remarque : marqueurs de cellule supplémentaires (tels que α-syn ou NeuN) peuvent être identifiés dans la même plate-forme d’analyse à l’aide des sections marqueur 1 ou marqueur 2 sous l’onglet analyse.</li>
	<li>Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions de paramètres.</li>
	<li>Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur Analyser.</li>
	<li>Choisissez le paramètre d’analyse que vous venez d’enregistrer et, dans la fenêtre Région d’analyse, cochez la case Couche(s) d’annotations. Ensuite, vérifiez la couche 1 et cliquez sur En fonction analyser. REMARQUE: Pour un seul cerveau, l’analyse prend généralement environ 5 minutes. Le résultat obtenu affichera clairement chaque élément qui a été compté comme une cellule(Figure 4).</li>
	<li>Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulative pour toutes les sections. Il existe une option pour exporter des données d’analyse d’objet, qui donnera des données détaillées, y compris la taille de cellule de chaque cellule individuelle détectée. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.</li>
	<li>Ajoutez le nombre total de cellules de chaque section analysée par animal et la surface totale analysée (mm2). Divisez le nombre total de cellules par la surface totale analysée pour calculer le nombre de cellules/mm2 dans le SNpc pour chaque rat</li>
</ol>

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimates+of+dopaminergic%2C+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area%2C+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li>
<li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).</li>
<li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li>
<li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li>
<li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1%2F2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation%2C+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson%27s+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698(2011).</li>
<li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).</li>
<li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li>
<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne font état d’aucun intérêt concurrent.

L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou semi-quantitatives seules...

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules est le comptage stéréologique non biaisé, qui utilise des sections transversales bidimensionnelles (2D) du tissu pour estimer les caractéristiques volumétriques dans les structures tridimensionnelles (3D)2,3,4. Les méthodes thétélogiques modernes basées sur la conception utilisent des procédures d’échantillonnage aléatoire complètes et appliquent des protocoles de comptage (connus sous le nom de sondes) pour éviter les artefacts potentiels et les erreurs systématiques, permettant une détection fiable des différences légèrement supérieures à la variation inter-animaux5. Tandis que la stéréologie fournit un outil analytique puissant pour des études histologiques in vivo, elle prend beaucoup de temps, suppose la préparation uniforme d’échantillon, et exige la validation à plusieurs étapes, qui peut avoir un impact de plus en plus l’efficacité de plus en plus exigée pour l’investigation translationnelle préclinique.
Les progrès technologiques récents de la science numérique permettent d’adopter de nouvelles applications pour des évaluations plus efficaces de la pathologie sans stéréomicroscope, tout en comblant un besoin de substitut de la stéréologie impartiale. Ces méthodes augmentent la vitesse, réduisent l’erreur humaine et améliorent la reproductibilité des techniques téréologiques6,7. HALO est l’une de ces plateformes d’analyse d’images pour l’analyse quantitative des tissus en pathologie numérique. Il comprend une variété de modules différents et rapporte des données d’expression morphologiques et multiplexées sur une base cellule par cellule à travers des sections entières de tissu utilisant des algorithmes de reconnaissance de formes. Le module FL cytonucléaire mesure la positivité immunofluorescente des marqueurs fluorescents dans le noyau ou le cytoplasme. Cela permet de signaler le nombre de cellules positives pour chaque marqueur et le score d’intensité pour chaque cellule. Le module peut être adapté pour fournir des mesures individuelles de la taille des cellules et de l’intensité, bien que cette fonctionnalité ne soit pas requise pour la quantification des neurones dopaminergiques.
Le but de cette étude est de vérifier cette méthode avec un modèle de rat α-syn à base de vecteur viral préalablement validé de neurodégénérescencenigrale 8,9,10. Dans ce modèle, le mutant humain A53T α-syn est exprimé dans le SNpc par injection stéréotaxique du sérotype hybride adéno-associé du virus 1/2 (AAV1/2), entraînant une neurodégénérescence significative sur une période de 6 semaines. Le SNpc non injecté contralatéral peut, dans certaines études, servir de contrôle interne pour le côté injecté. Plus communément, l’injection de vecteur vide AAV (AAV-EV) dans une cohorte témoin d’animaux est utilisée comme témoin négatif. Nous présentons un guide étape par étape pour estimer la densité des neurones dopaminergiques restant dans le SNpc injecté après 6 semaines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>Anticorps A-Syn</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32-8100</td><td></td></tr><tr><td>ABC Elite</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6102</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Anticorps secondaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-28180</td><td></td></tr><tr><td>Alcalin phosphatase conjuguée anti-lapin</td><td>igG Jackson Immuno</td><td>111-055-144</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoire de vecteurs</td><td>IgG anti-souris biotinylés</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Médium de mouting fluorescent Agilent</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>HALO&trade ;</td><td>Indica Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Diamed</td><td>HS202</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Substrat de peroxydase</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>LSM880 Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Anticorps Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vector Labs S-1000-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td></td></tr><tr><td>Microtome coulissant</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC700</td><td></td></tr><tr><td>TH Anticorps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21962</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount support de montage</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de phosphatase alcaline Vector</td><td>Labs</td><td>SK-5300</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.

En appliquant les méthodes ci-dessus au tissu cérébral collecté 6 semaines après les injections d’AAV, nous avons démontré que l’injection stéréotaxique d’AAV exprimant le mutant A53T α-syn (AAV-A53T) dans le SNpc du cerveau de rat entraîne une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques par rapport à l’injection d’AAV vectoriel vide (AAV-EV) comme contrôle(Figure 5A,B). Le nombre moyen de neurones/mmTH-positifs 2 dans le SNpc des rats injec...

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans le nigra de substantia est une mesure de résultats clé dans la recherche sur la maladie de Parkinson. Ce protocole raccourcit considérablement la charge de travail requise pour estimer le nombre de neurones. Cette méthode fournit un processus efficace dans le temps et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques et convient pour déterminer l’effet des interventions sur la survie cellulaire.Cette méthode pourrait être facilement adaptée pour fournir des comptages précis de neurones dans différentes régions du cerveau tout en maintenant les avantages de coût et de temps par rapport aux méthodes thétéologiques traditionnelles. Pour capturer des images IHC, utilisez le logiciel couplé à un microscope confocal à un grossissement 10X. Ouvrez le trou de la goupille à 1,5 unité de surface pour capturer un plan large totalisant 1,5 micromètre et mettre l’accent sur le côté injecté du cerveau.Dans l’onglet Acquisition, cochez l’option d’imagerie par balayage de tuiles et définissez les dimensions sur 10 par quatre. Sous le panneau du mode d’acquisition, définissez le zoom sur 1.1 pour éviter toute marque d’assemblage entre les images de numérisation de tuiles. Définissez la taille d’image sur 1024 par 1024 pixels et la moyenne sur deux pour garantir l’acquisition d’images de haute qualité.Dans le panneau des canaux, définissez la piste un sur Alexa 488 et la piste deux sur Alexa 555. Chargez la glissière sur la scène et choisissez une section avec une forte coloration TH. Cliquez en direct sur le panneau d’acquisition.Dans le panneau des canaux, réglez la force et le gain du laser à des niveaux qui maximisent le signal et limitent le bruit de fond. Utilisez l’indicateur de portée pour vous assurer que les signaux ne sont pas surexposés. Répétez cette opération avec plusieurs diapositives.Sous l’onglet acquisition, cochez la case positions. Pour commencer l’imagerie, utilisez l’oculaire et choisissez la première section montrant une coloration TH positive. Ensuite, définissez le focus sur le point d’intérêt et déplacez la scène vers la ligne médiane de la section.Cela enregistre la position dans les axes X, Y et Z et image une analyse de tuiles capturant toute la section. Répétez cette opération pour toutes les autres diapositives, y compris un site non injecté. Séparez les fichiers image à l’aide du logiciel approprié et importez-les dans un logiciel d’analyse d’image automatisé.Définissez une région d’intérêt en sélectionnant l’outil d’annotation plume pour dessiner une annotation autour de substantia nigra pars compacta. Passez à l’onglet Analyse et sélectionnez réglage en temps réel dans le menu déroulant Analyser. Cela ouvre une fenêtre séparée sur l’image de la section permettant de modifier en temps réel les paramètres d’analyse.Sous la section grossissement de l’analyse, sélectionnez le zoom d’image approprié. Dans la section détection cellulaire, sélectionnez le colorant nucléaire comme colorant utilisé pour la coloration TH. Ajustez le seuil de contraste nucléaire, l’intensité nucléaire minimale, l’agressivité de la segmentation nucléaire et les paramètres de taille nucléaire tout en surveillant attentivement la fenêtre de réglage du temps.Répétez ce processus avec plusieurs échantillons. Une fois qu’un nombre approprié d’images a été échantillonné et que le réglage en temps réel a été ajusté en conséquence, enregistrez les paramètres d’analyse dans le menu déroulant Actions des paramètres. Sélectionnez toutes les images à analyser et cliquez sur analyser.Choisissez le paramètre d’analyse qui vient d’être enregistré et, dans la fenêtre de la région d’analyse, cochez la case Couches d’annotations, puis cochez la première couche et cliquez sur Analyser. Une fois terminé, exportez les données d’analyse récapitulatives pour toutes les sections en sélectionnant l’option d’exportation des données d’analyse d’objet. Cet ensemble de données pourrait être utilisé pour examiner les changements dans la taille des cellules en réponse à une toxine ou à un traitement.Pendant six semaines après des injections associées de virus ou d’AAV d’adeno, l’injection stereotactic d’AAV exprimant l’alpha synuclein du mutant A53T dans le nigra de substantia dans le cerveau de rat a eu comme conséquence une réduction significative de la densité des neurones dopaminergiques. Le nombre moyen de neurones positifs de TH par millimètre au carré dans le nigra de substantia des rats injectés avec AAV-A35T a été sensiblement diminué par rapport à celui des rats injectés avec le vecteur vide d’AAV. Des observations semblables ont été faites utilisant la stéréologie impartiale.Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que le logiciel n’est aussi utile que s’il est formé pour l’être. Par conséquent, il faut prendre le temps et le soin de s’assurer qu’une seule cellule est identifiée comme une seule cellule. Le logiciel peut être adapté pour mesurer une intensité de fluorescence d’autres protéines d’intérêt telles que l’alpha-synucléine afin de déterminer si les traitements peuvent moduler les niveaux de protéines.Cette technique a permis une plus grande efficacité lors de l’essai de l’effet de plusieurs thérapies potentielles sur la densité des neurones dopaminergiques.

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Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images (Vidéo) | JoVE Journal

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

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