Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

Les cellules souches du gliome sont une sous-population de cellules du gliome, qui sont généralement résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Nous avons décrit ici la méthode d’identification rapide des thérapies combinées, ciblant les cellules souches du gliome, au lieu des cellules de gliome différenciées. Par rapport à d’autres méthodes, qui peuvent être laborieuses et compliquées.

Ce protocole est relativement simple et rapide, pour identifier les combinaisons de médicaments potentiellement utiles. Commencez par prélever les cellules souches de gliome ou GSC dans le milieu de culture et centrifugez-les à 70 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, digérez les cellules avec de l’accutase pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pointe de 200 microlitres, pipettez les cellules à plusieurs reprises pour les dissocier et ressuspendez la pastille cellulaire. Ajouter les CSM à une densité de 200 000 cellules dans un millilitre de milieu de culture, dans chaque puits d’une plaque de culture de 12 puits, et les incuber pendant la nuit. Oh le lendemain, ajoutez 30 microlitres de surnageant du virus luciférase-eGFP dans chaque puits de la plaque.

Centrifugez les cellules à 1000 fois G pendant deux heures, à 25 degrés Celsius et incubez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu dans les puits en collectant les CGV, en les centrifugant, en retirant le surnageant, en les resusmettant en milieu frais et en les replaquant. Culturez les cellules pendant encore 48 heures.

Observez la plaque sous un microscope fluorescent et confirmez l’apparition de cellules GFP positives. Triez et collectez les CSC à haute fluorescence à l’aide d’un trieur de cellules à flux et essez-les en culture. Enduire, 96 plaques de fond optiques avec un mélange de matrice extracellulaire, comme le matrigel, et les incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Retirez l’excès de mélange et rincez doucement les plaques une fois avec du PBS, puis ensemencez des cellules XG387-Luc à une densité de 1000 cellules dans 100 microlitres de milieu de culture, et à chaque puits des plaques enduites et les culturez pendant la nuit. Le lendemain, observez les cellules au microscope pour confirmer leur fixation à la plaque. Ensuite, préparez une solution de témozolomide de 200 micromolaires et deux solutions micromolaires des agents ciblés, en milieu de culture.

Pour le dépistage des médicaments combinés, retirez le milieu vierge et ajoutez le milieu contenant soit 200 témozolomides micromolaires ou deux agents micromolaires ciblés, ou une combinaison des deux, dans chaque puits pour trois répétitions techniques par traitement. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Prenez des images de la bioluminescence cellulaire dans la plaque à l’aide du système d’imagerie à spectre IVIS.

À l’aide du logiciel intégré, créez plusieurs zones circulaires de la région d’intérêt et quantifiez la bioluminescence cellulaire. Afin d’identifier des candidats potentiels susceptibles d’améliorer l’effet antiglioblastome du témozolomide, 20 inhibiteurs sélectifs de petites molécules cibles ont été analysés par le biais d’un dépistage combiné de médicaments. Les valeurs d’indice sensibles de 13 agents ciblés étaient supérieures à zéro et cinq d’entre eux étaient supérieures à 0,1.

L’indice sensible des deux principaux médicaments candidats UMI-77 et A 83-01 était supérieur à 0,25, ce qui suggère leur potentiel de synergie avec le témozolomide. Le traitement combiné du témozolomide et de l’UMI-77 a été évalué à l’aide d’un dosage anti-prolifératif dans une matrice de titration à six doses par six. Les valeurs de l’indice combiné étaient inférieures à un.

Et les valeurs élevées d’agent unique étaient supérieures à zéro pour la plupart des combinaisons de témozolomide et d’UMI-77 à différentes concentrations. Suggérant une interaction synergique globale du témozolomide et de l’UMI-77 dans les CSG XG387 et XG328. Ce protocole peut également être appliqué pour trouver une combinaison de médicaments en utilisant des cellules cancéreuses adhérentes en supprimant simplement l’étape de revêtement de la plaque.