Optimisation du modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne pour limiter la variabilité

Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour l’occlusion veineuse rétinienne à l’aide de rose bengale et un système de microscope d’imagerie rétinienne guidé par laser avec des recommandations pour maximiser sa reproductibilité dans les souches génétiquement modifiées.

Le protocole fournit un modèle pour étudier les mécanismes des lésions vasculaires et le développement ultérieur de l’œdème de manière non invasive. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez suivre la blessure en direct dans le temps sans intervention chirurgicale. Cela permet de tester les traitements plus efficacement.

Il peut être difficile d’apprendre à effectuer correctement les veines de la queue et à accueillir correctement l’animal dans la plate-forme. Pour les deux techniques, je recommande d’être patient et de prendre les choses lentement. Pour commencer, manipulez délicatement le câble à fibre optique et connectez-le au boîtier de commande laser et à l’adaptateur laser du microscope imageur rétinien, puis allumez le boîtier de lampe du microscope imageur rétinien.

Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie. Placez un morceau de papier blanc devant l’oculaire du microscope et ajustez la balance des blancs en cliquant sur Ajuster dans le programme d’imagerie. Allumez le boîtier de commande laser en tournant la clé et en suivant les instructions sur l’écran du boîtier de commande laser.

Pour vérifier la puissance laser de base, réglez le boîtier de commande laser sur 50 milliwatts et 2 000 millisecondes. Ensuite, allumez le laser et placez le capteur de puissance devant l’oculaire. Appuyez sur la pédale de commutation pour activer le laser, en visant une puissance de 13 à 15 milliwatts.

Ensuite, à l’aide de l’écran du boîtier de commande laser, réglez la puissance du laser expérimental à 100 milliwatts et 1 000 millisecondes, puis éteignez le laser. Versez 300 millilitres d’eau dans un bécher de 500 millilitres et réchauffez le bécher dans un four à micro-ondes pendant une minute. Ensuite, placez une gaze dans l’eau chaude.

Ensuite, placez une souris mâle de deux mois dans un dispositif de contention. Appuyez doucement sur la gaze chaude dans la queue de la souris et recherchez les veines dilatées. À l’aide d’une aiguille de calibre 26, injectez la quantité appropriée de rose bengal en fonction du poids de l’animal et appliquez une pression sur le site d’injection pour prévenir l’hématome ou le saignement avant d’essuyer le site.

Ensuite, relâchez la souris de la retenue et ramenez-la dans la cage. Laisser circuler huit minutes au bengale rose avant l’injection d’anesthésiques. Allumez la plate-forme de la souris chauffée.

Ajoutez ensuite une goutte de phényléphrine et de tropicamide dans chaque œil de la souris. Après avoir confirmé l’anesthésie, ajoutez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne par œil, puis ajoutez une pommade oculaire aux deux yeux. Ensuite, injectez 150 microlitres de carprofène par voie sous-cutanée entre les oreilles.

Ensuite, placez la souris sur la plate-forme et ajustez la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette. Comptez les veines rétiniennes et prenez une image du fond d’œil. Ensuite, allumez le laser et visez une veine rétinienne à environ 375 micromètres du disque optique.

Irradiez le récipient en appuyant sur la pédale et en déplaçant légèrement le faisceau laser jusqu’à 100 micromètres. Répétez cette étape trois fois et déplacez le faisceau laser après chaque impulsion afin que l’irradiation ne soit pas focalisée en un seul endroit. Répéter l’irradiation sur d’autres vaisseaux principaux pour obtenir deux à trois occlusions.

Après avoir irradié les récipients, éteignez la lampe et attendez 10 minutes. Rallumez ensuite la lampe, comptez le nombre de veines obstruées et prenez une image du fond d’œil. Après l’acquisition de l’image et l’injection de solution saline, ajoutez des gouttes oculaires lubrifiantes et une pommade en gel sur les deux yeux.

Observez la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie et ne la remettez dans la cage avec d’autres animaux que lorsqu’elle est complètement rétablie. Le nombre d’occlusions obtenues immédiatement après l’irradiation au laser n’était pas différent entre les animaux qui ont été traités au laser 10 et 20 minutes après l’administration de rose bengale. Le nombre d’occlusions subies jusqu’à un jour après l’occlusion veineuse rétinienne a significativement diminué chez les animaux traités au laser 20 minutes après l’administration de rose bengal, indépendamment du génotype.

Sans modifier la puissance expérimentale de 100 milliwatts, une faible puissance laser de base de 11,5 milliwatts n’a entraîné aucune occlusion. En revanche, une sortie laser de base de 13,5 milliwatts a entraîné des occlusions réussies. Quatre principaux types d’occlusions se produisent après la photocoagulation au laser: les vaisseaux complètement obstrués, les vaisseaux partiellement obstrués, les vaisseaux partiellement reperfusés et les vaisseaux entièrement perfusés.

Le système vasculaire irradié des souris knockout Casp9 inductibles par les cellules endothéliales inductibles au tamoxifène a passé plus de temps dans des états partiellement reperfusés et partiellement occlus que celui des souris C57 Black 6, qui ont passé plus de temps dans des états complètement occlus. L’état d’occlusion des vaisseaux change rapidement dans les 10 premières minutes après la photocoagulation au laser et les hémorragies en forme de flamme observées 24 heures après la blessure. Différentes pathologies ophtalmiques sont survenues après une occlusion veineuse rétinienne.

Le niveau d’œdème rétinien après occlusion veineuse rétinienne peut être quantifié dans les yeux blessés à l’aide d’images de tomographie par cohérence optique. L’état des couches neuronales peut également être déterminé en évaluant la désorganisation des couches internes de la rétine. Un exemple d’image de tomographie par cohérence optique avec les étiquettes correspondantes pour chaque couche est présenté ici.

Il est important de mesurer la puissance laser de base. Cette lecture aura un impact considérable sur le succès des occlusions et peut être optimisée. Des méthodes supplémentaires telles que OCT, ERG et Optiger peuvent être effectuées.

Cela aidera à traiter les effets des lésions neurovasculaires sur l’intégrité neuronale rétinienne et la fonction des voies visuelles. Cette technique ouvre la voie à l’interrogation des voies moléculaires à l’origine des maladies neurovasculaires et, en suivant des animaux individuels au fil du temps, fournit des données qui peuvent être plus facilement traduites en maladies humaines.