비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

NASH는 세계에서 가장 중요한 만성 간 질환 중 하나입니다. 섬유증, 간경변, 결국 간암으로 진행될 수 있습니다. NASH에서 ECM의 동적 변화를 연구하면 섬유증을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기존의 이미징은 3D ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 과정에 대한 이해를 제한합니다. 시작하려면 절차 전에 마우스의 무게를 잰다. 마우스를 마취시킨 후 이발기로 복부 부위를 면도하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.

마우스를 뒤쪽에 놓고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정시킵니다. Mayo 가위와 Adson 집게를 사용하여 하복부에서 측면으로 3cm 절개를합니다. 그런 다음 흉강을 열지 않고 하복부에서 xiphoid 과정까지 수직으로 5cm 절개합니다.

복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽에 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터로 간 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다. 문맥을 카테터로 삽입하려면 24게이지 IV 카테터를 문맥의 말단부에 유도합니다. 문맥이 간엽으로 분기되기 전에 카테터 팁을 놓습니다.

카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1밀리리터 주사기를 사용하여 PBS로 간을 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 위치하는지 확인합니다. Dumont 마이크로 집게, Castroviejo 미세 바늘 및 4-0 봉합사를 사용하여 문맥 분기 아래에 스티치를 배치하고 1cm 아래에 두 번째 스티치를 배치하여 카테터를 고정합니다.

카테터를 루어 커넥터로 길이 1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm의 실리콘 튜브에 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다. 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 하십시오.

연동 펌프를 분당 0.2밀리리터의 유량 출력으로 설정합니다. 먼저 탈이온수로 2시간 동안 정독하면 관류 중에 간의 색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다. 관류 용액을 0.5% 데옥시콜산나트륨으로 전환하고 밤새 계속하면 관류가 끝날 때 간이 하얗게 됩니다.

관류 용액을 탈이온수로 전환하고 2시간 동안 관류합니다. Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위를 사용하여 탈세포화된 간을 채취하고 PBS가 포함된 페트리 접시에서 조심스럽게 씻습니다. 탈세포화된 간의 작은 조각을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 중간에 놓습니다.

조직 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10마이크로리터의 퇴색 방지 장착 매체를 조직에 추가합니다. 커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉하십시오.

커버 유리 상단에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 20X 오일 대물 렌즈가 이멀젼 오일에 닿을 때까지 내립니다. 파장 405 나노 미터의 보라색 채널로 전환하십시오.

셔터를 켜고 샘플의 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.

2 광자 레이저를 시작하려면 컴퓨터 제어로 전환하고 먼저 2 광자 레이저를 켭니다. 그런 다음 두 개의 광자 레이저 컨트롤러와 셔터를 켜서 출력 전력이 2.5와트보다 높은지 확인합니다. 형광 소광을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄입니다.

선택한 형광단을 수용하기 위해 광증배관과 하이브리드를 모두 선택하고 조정하십시오. 동시 또는 순차적 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다.

레이저 파장, 게인, 파워를 조정하고, 픽셀 체류 시간 오프셋, 픽셀 크기 평균화 및 확대/축소를 수행합니다. 컴퓨터 Z 컨트롤러를 스크롤하고 Z 치수를 설정합니다. 시작 및 끝점을 정의하고 볼륨 내에 지정된 이미지 수를 선택합니다.

이미지를 획득합니다. 두 광자 현미경을 수행한 후, 탈세포화되지 않은 콜라겐 섬유는 콜라겐 네트워크의 저해상도 이미지를 나타냈습니다. 탈세포화된 세포외 기질에서, 차우와 패스트푸드 식단 간 사이의 형태 및 공간 분포에서 명백한 차이가 관찰되었습니다.

차우 다이어트를 한 콜라겐 섬유와 마우스는 서로 얽히고 잘 조직된 네트워크를 보인 반면, 패스트푸드 다이어트를 한 마우스는 연결성이 낮은 콜라겐 다발을 보여주었습니다. 간 세포외 기질의 3차원 구조는 차우 다이어트를 한 쥐의 콜라겐 섬유가 잘 조직된 네트워크를 보였지만 패스트푸드 다이어트 마우스에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 탈세포화된 세포외 기질에서 원섬유 콜라겐의 품질을 확인하기 위해, 슬라이드를 헤마톡실린 에오신 및 피크로시리우스 레드로 염색하였다.

헤마톡실린과 에오신은 모든 세포가 제거되었음을 보여줍니다. Picrosirius red 염색 이미지에서, 차우 먹인 쥐의 세포 외 기질은 잘 조직 된 네트워크를 나타냈다. 대조적으로, 패스트 푸드 다이어트를하는 쥐는 더 조밀 한 콜라겐 섬유를 보여주었습니다.

관류하기 전에 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 거품은 간에서 혈관을 막고 관류에 영향을 미칩니다.