CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 진행중인 간 염증성 질환에서 백혈구의 이동과 상호 작용을 추적하는 것입니다. 이러한 세포가 간 조직으로 어떻게 동원되는지, 그리고 면역 병리학에 잠재적으로 관여하는 기저에 있는 일련의 사건을 더 잘 이해합니다. 이는 먼저 기관절개술을 수행하여 생쥐의 호흡을 조절함으로써 달성되며, 이는 동물의 장기적인 생존을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.

두 번째 단계로, 마우스는 개복술을 통해 간을 외과적으로 노출시켜 다광자 현미경으로 장기에 접근할 수 있습니다. 다음으로, 간을 고정하고 위치시키면 움직임 인공물을 최소화하기 위해 간을 삽입하여 위치를 잡을 수 있습니다. 이미징은 몇 시간에 걸쳐 수행될 수 있으며, 이는 개별 백혈구의 모집, 위치 및 상호 작용의 변화를 따르는 고해상도 타임 랩스 시퀀스로 이어질 수 있습니다.

간 염증이 발생하는 과정에서 이 방법은 백혈구 모집, 세포 세포 상호 작용 또는 면역 병리학 메커니즘과 같은 급성 및 만성 간 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 현미경 검사와 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 다초점 현미경 검사가 낮은 망아지 표백 또는 광독성으로 샘플 섭동이 거의 없이 장기간 이미징할 수 있을 뿐만 아니라 조직 깊숙이 최대 100마이크로미터 깊이의 광학 슬라이스를 촬영할 수 있다는 것이며, 이는 원적외선 레이저 광선 레이저의 고유한 물리학 때문입니다. 이 방법은 간 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

다른 시스템에 쉽게 채택할 수 있습니다. 안정화 및 고정 방법 이후 조직은 생체 내 현미경 검사의 거의 모든 질문에 적용 할 수 있으므로 유창한 관련 세포를 사용하여 비장, 신장 또는 피하 종양과 같은 장기를 쉽게 이미지화 할 수 있습니다. 또한 모든 백혈구 하위 집합을 시각화하고 상호 작용 및 간 염증을 보낼 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 소동물 수술의 극도의 복잡성 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 그러나 우리 자신의 경험으로 인해 이것은 몇 주 동안만 제한 요소일 뿐이며 일상적으로 약간의 실습이 필요합니다.간 조직의 취약성으로 인해 준비 단계를 배우기 어렵고 방법의 시각적 시연이 필수적입니다. 마취제를 설정한 후 마우스 아로 스테이지에 3%아로스를 채우고 40도 각도로 붓습니다.

그런 다음 수술 작업 영역이 완전히 소독되어 있는지, 필요한 모든 기구 등이 소독되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 마취 칵테일의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 5분 후, 동물의 반사 신경을 확인한 후 피부를 소독하고 눈에 안과 연고를 바릅니다.

이제 마우스를 준비 테이블에 고정합니다. 테이프를 사용하여 목을 부드럽게 과도하게 늘리는 복부 쪽이 노출되도록 배치합니다. 앞니에 걸린 고무줄로 이를 수행할 수 있습니다.

이제 턱 아래를 약 0.5cm에서 1cm 길이로 절개합니다. 그런 다음 타액선 사이의 결합 조직을 조심스럽게 절개하고 기관을 둘러싼 근육관을 찾습니다. 근육을 부드럽게 찢어 기관이 드러나도록 합니다.

기관 아래의 실을 당긴 다음 절개 부위를 T 자 절개를 사용하여 마이크로 가위로 기관을 엽니다. 환기 튜브를 약 50cm 정도 삽입하십시오. 작은 해부학적 집게를 사용하여 튜브를 전진시킵니다.

그런 다음 봉합사로 튜브를 고정합니다. 그런 다음 보안을 강화하기 위해 튜브를 피부에 봉합하고 시아노아크릴레이트를 사용하여 절개 부위를 밀봉하고 튜브를 동물의 머리에 고정합니다. 접착 테이프를 사용하여 2%iso 불소의 연속 흐름을 사용하여 마취를 유지합니다.

수술을 위해 마우스를 준비한 후 흉골 아래에 작은 피부 절개를 만들고 양쪽 갈비뼈 아래 측면으로 절단면을 확장합니다. 이 과정에서 노출된 모든 혈관을 소작하십시오. 출혈을 최소화하려면 선형 팔꿈치에서 작은 초기 절단을 수행하여 복강에 접근합니다.

절단면을 수평으로 확장하여 모든 혈관을 밀봉하고 간에 접근할 수 있도록 합니다. 이제 마우스를 농업 스테이지로 옮기고 동물의 양쪽에 슬라이드를 쌓아 제자리에 고정합니다. 이러한 스택은 마우스의 높이와 일치해야 나중에 배치될 간 단계가 복부에 과도한 압력이 가해지지 않도록

이제 흉골에 봉합사를 사용하여 갈비뼈를 집어넣습니다. 4개의 제로 봉합사로 충분합니다 갈비뼈를 집어넣은 후 간과 횡격막을 연결하는 인대를 대동맥까지 절단하되 혈관이 파열되거나 절단되지 않도록 각별히 주의하여 작업합니다. 또한 간과 위장관을 연결하는 인대를 절단합니다.

마우스를 45도 돌리면 더 큰 간엽에 대한 접근성이 향상됩니다. 표준 커버 슬립을 가져 와서 날카롭지 않도록 가장자리를 따라 테이프로 붙입니다. 복강 위에 놓습니다.

이것은 간이 간을 무대에 위치시키는 무대 역할을 할 것입니다. 더블 볼 스타일러스 프로브나 푹신한 주걱을 간 아래로 조심스럽게 밀어 넣고 장기 상단을 잡습니다. 촉촉한 역학 조직을 사용하면 간 조직이 즉시 병변을 입게 되므로 장기를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다.

그런 다음 로브를 슬라이드로 들어 올리고 부드럽게 잡아당겨 제자리에 놓습니다. 로브는 일반적으로 구부러지거나 접히게 되며, 얇은 주걱이나 촉촉한 티슈로 조직을 들어 올려 가장자리를 펴려고 합니다. 다음으로, 커버 슬립 또는 슬라이드 형태의 측면 지지대를 추가합니다.

커버 슬립을 간엽과 같은 높이로 쌓으십시오. 간의 병기 결정 및 고정은 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 기계적 스트레스, 비틀림 또는 압력은 즉각적인 조직 손상이나 최소한 정현파 혈관의 혈류 장애로 이어질 수 있습니다.

이제 측면 지지대에 의해 지지되는 간엽 위에 가장자리가 테이프로 감겨 있는 큰 커버 슬립을 끼웁니다. 이 커버 슬립을 가능한 한 수평으로 배치하십시오. 간을 압박해서는 안 됩니다.

흰색 조직은 영상이 빠르게 진행되지 않는 한 혈류 장애가 있음을 나타냅니다. 이제 장기 마취를 제공하고 G five를 적용하기 위해 두 개의 독립적인 복강내 카테터를 삽입해야 합니다. 이들은 27 게이지 바늘과 유연한 실리콘 튜브로 조립됩니다.

그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 흐름을 시작합니다. 카테터를 뒷다리 근처의 하복부에 삽입합니다. 바이탈 모니터를 마우스에 부착한 후 하나의 XPBS에 100%aros 3ml를 준비합니다.

아로스가 섭씨 41도까지 냉각되면 18게이지 바늘이 달린 5밀리리터 주사기를 사용하여 간을 삽입하십시오. 에어로스가 냉각되면 하이데만 주걱을 사용하여 초과분을 제거하고 간을 스캔할 수 있을 만큼 큰 시야를 노출시킵니다. 그런 다음 스캔을 계속합니다.

시야가 준비된 후 현미경 아래로 마우스를 이동하여 타임랩스 이미징을 위한 적절한 스캐닝 영역을 선택합니다. 간 조직은 충분한 혈류와 최소한의 샘플 섭동을 가진 대표 필드를 식별하는 외부 백색 광원을 사용하여 눈으로 스캔합니다.CXCR 6 개의 GFP 이형 접합 마우스는 실험으로 생체 내 T-P-L-S-M 이미징을 수행했습니다. 일부는 급성 간 손상을 유발하기 위해 복강에 테트라클로라이드 주사를 맞았다.

GFP를 발현하는 모달 세포는 비디오로 추적되었으며 세포 이동성의 스냅샷을 얻기 위해 그 트랙을 중첩했습니다. 그런 다음 트랙을 정규화했습니다. 정상적인 간은 무작위 이동 패턴을 가진 세포를 가지고 있었습니다.

CCI 4를 주입한 간은 세포 이동에 장애가 있는 것으로 나타났습니다. 기원으로부터의 총 치환을 측정한 결과, CCI 4회 처리 후 36시간 후에 간세포 손상 부위에 세포 포획이 있었다는 것이 분명했습니다. 간 손상에 의한 이동 장애는 시간 경과에 따른 개별 세포의 이동 속도를 그래프로 표시하여 18시간 후 부분 정지와 36시간 후 완전 이동 정지를 보여줌으로써 나타낼 수도 있습니다.

이동하는 세포의 속도 감소는 세포를 집단으로 비교할 때 통계적으로 유의한 것으로 나타날 수도 있습니다. 따라서 이 접근 방식은 간 질환 발병에서 세포 이동 및 포지셔닝의 변화를 추적하는 데 적합합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 내 다중 사진 현미경 검사를 위해 마우스의 간을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

여기에서 제공하는 방법을 통해 동물의 장기 생존을 안정화할 수 있을 뿐만 아니라 우리가 제공하는 부드러운 고정 방법으로 인한 움직임 아티팩트를 최소화할 수 있습니다. 일단 마스킹되면 이 기술을 제대로 수행하면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다 이 과정에서 온도, 심박수, 산소 및 CO2 수준을 안정화하는 동물의 필수 매개변수를 제어하는 것이 중요합니다. 이것은 괴사와 호흡의 깊이를 조정함으로써 달성 할 수 있습니다.이 기술에 따라.

유세포 분석 또는 레이저 캡처 미세 해부와 같은 다른 절차를 수행하여 조직 또는 침투 세포에서 분비되는 침투 면역 세포 또는 매개체의 표현형과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 간에서 백혈구 트래픽과 세포 상호 작용의 역학에 대한 통찰력을 얻을 수 있었으며, 이를 통해 염증성 간 질환으로 이어지는 일련의 사건을 분석할 수 있었습니다. 다중 사진 현미경 검사에 사용되는 고에너지 펄스 적외선 레이저로 이미징을 수행하는 레이저 보안 지침을 따르십시오.

이 실험을 수행하는 동안 레이저 방사선의 반사가 눈과 피부에 위험을 초래하지 않도록 하십시오.