CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 진행성 간 염증성 질환에서 백혈구의 이동과 상호작용을 추적하는 것입니다. 이는 이러한 세포들이 간 조직으로 어떻게 모집되는지에 대한 일련의 사건들과 면역 병리학에서의 잠재적 관여도를 더 잘 이해하기 위함입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 호흡을 제어할 수 있도록 기관 절개술을 수행하며, 이는 동물의 장기 생존을 보장하기 위한 결정적인 단계입니다.

두 번째 단계로, 마우스의 복강을 절개하여 간을 외과적으로 노출시켜 다광자 현미경으로 해당 장기에 접근할 수 있도록 합니다. 다음으로, 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화하기 위해 간을 로즈(rose)에 매립하여 고정하고 위치를 잡습니다. 수 시간에 걸쳐 이미징을 수행함으로써 개별 백혈구의 모집, 배치 및 상호작용의 변화를 추적하는 고해상도 타임랩스 시퀀스를 얻을 수 있습니다.

간 염증 발생 과정에서, 본 방법은 백혈구 모집, 세포 간 상호작용 또는 면역 병리학적 기전과 같이 급성 및 만성 간 염증 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 기존 현미경 방식과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 다초점 현미경(multifocal microscopy)을 통해 표본의 섭동을 거의 일으키지 않으면서 광퇴색이나 광독성이 낮은 장기 영상 촬영이 가능하다는 점이며, 원적외선 레이저 광선의 독특한 물리적 특성 덕분에 조직 내부 최대 100 µm 깊이까지 광학적 단면 촬영이 가능합니다. 따라서 본 방법은 간 질환에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 다른 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 조직 안정화 및 고정 방법 덕분에, 이 기술은 사실상 모든 생체 내 현미경 관찰 질문에 적용 가능하며, 따라서 유동적인 관련 세포를 이용해 비장, 신장 또는 피하 종양과 같은 장기를 쉽게 영상화할 수 있습니다. 또한 모든 백혈구 서브셋을 시각화하고 이들의 상호작용과 간 염증을 관찰하는 것도 가능합니다.

일반적으로, 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 소동물 수술의 극심한 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 하지만 저희의 경험에 비추어 볼 때, 이는 단지 몇 주 동안만 제한 요소가 될 뿐이며 약간의 실습 루틴만으로 충분합니다. 간 조직의 취약성 때문에 준비 단계를 익히기가 어려우며, 이 방법에 대한 시각적 시연이 필수적입니다. 마취제 설정을 마친 후, 마우스로 스테이지에 3%aros를 40도 각도로 부어 채웁니다.

그 다음 수술 부위와 필요한 모든 기구 등을 완전히 소독하십시오. 그런 다음 마취제 칵테일을 복강 내 주입하여 마우스를 마취합니다. 5분 후 동물의 반사 작용을 확인하고, 피부를 소독한 뒤 눈에 안연고를 도포하십시오.

이제 마우스를 준비대에 고정합니다. 테이프를 사용하여 마우스의 복측이 노출되도록 배치하고 목을 부드럽게 과신전시킵니다. 절치에 고무줄을 걸어 이 작업을 수행할 수 있습니다.

이제 턱 아래에 약 0.5~1cm 길이의 초기 절개를 수행합니다. 그런 다음 타액선 사이의 결합 조직을 조심스럽게 박리하여 기관을 둘러싸고 있는 근육관을 찾습니다. 근육을 부드럽게 젖혀 기관을 노출시킵니다.

기관 아래로 실을 당긴 다음, 절개 부위에 T자형 절개를 가하여 미세 가위로 기관을 엽니다. 환기 튜브를 약 0.5 cm 정도 삽입합니다. 소형 해부학적 포셉을 사용하여 튜브를 전진시킵니다.

그 다음 봉합사로 튜브를 고정합니다. 더욱 확실히 하기 위해 튜브를 피부에 봉합하고, cyanoacrylate를 사용하여 피부 절개 부위를 밀봉한 뒤 튜브를 동물의 머리에 고정합니다. 접착 테이프를 사용하여 2% iso fluorine의 지속적인 흐름으로 마취 상태를 유지합니다.

수술을 위해 마우스를 준비한 후, 흉골 아래에 작은 피부 절개를 만들고 갈비뼈 아래 양측으로 절개선을 확장합니다. 이 과정에서 노출된 모든 혈관을 소작합니다. 출혈을 최소화하기 위해, 복강에 접근할 수 있도록 선상 팔꿈치 부위에 작은 초기 절개를 실시합니다.

절개 부위를 가로로 확장하여 모든 혈관을 봉쇄하고 간에 접근할 수 있도록 합니다. 이제 마우스를 agro 스테이지로 옮기고, 동물을 고정하는 데 도움이 되도록 양옆에 슬라이드를 쌓습니다. 이 슬라이드 더미는 마우스의 높이와 일치해야 하며, 이를 통해 나중에 배치될 간용 스테이지가 복부에 과도한 압력을 가하지 않도록 합니다.

이제 흉골에 봉합사를 사용하여 갈비뼈를 견인합니다. 4-0 봉합사면 충분합니다. 갈비뼈를 견인한 후, 간과 횡격막을 연결하는 인대를 절단합니다. 대동맥까지 완전히 절단하되, 혈관이 파열되거나 잘리지 않도록 각별히 주의하며 작업하십시오. 또한 간과 위장관을 연결하는 인대도 절단합니다.

더 큰 간 엽에 더 쉽게 접근할 수 있도록 마우스를 45도 회전시킵니다. 표준 커버 슬립의 가장자리를 테이프로 감싸 날카롭지 않게 만든 후, 이를 복강 위에 놓습니다.

이는 간을 스테이지 위에 배치하기 위한 받침대로 사용됩니다. 더블 볼 스타일러스 프로브(double ball stylus probe) 또는 패딩 처리된 스패튤라를 간 아래로 조심스럽게 밀어 넣어 장기의 윗부분을 잡습니다. 젖은 티슈를 사용할 때 가해지는 기계적 압력은 즉시 간 조직에 손상을 줄 수 있으므로, 장기를 매우 주의해서 다루는 것이 중요합니다.

그런 다음 엽을 슬라이드 위로 들어 올려 조심스럽게 당겨 위치를 잡습니다. 엽은 보통 구부러지거나 접힌 상태가 되는데, 얇은 스패튤라나 젖은 티슈로 조직을 들어 올려 가장자리를 조심스럽게 폅니다. 다음으로, 커버슬립이나 슬라이드를 사용하여 측면 지지대를 추가합니다.

커버슬립을 간엽의 높이와 동일하게 쌓습니다. 간의 스테이징(staging)과 고정은 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 어떠한 기계적 스트레스, 비틀림 또는 압력도 즉각적인 조직 손상이나 최소한 정맥동 혈관의 혈류 장애를 유발합니다.

이제 측면 지지대로 고정된 간 엽 위에 가장자리가 테이프로 처리된 커다란 커버 슬립을 덮으십시오. 이 커버 슬립을 최대한 수평으로 배치하십시오. 이때 간이 눌리지 않도록 주의해야 합니다.

영상이 빠르게 진행되지 않는 한, 조직이 하얗게 보이면 혈류가 손상되었음을 나타냅니다. 이제 장기 마취를 유지하고 G five를 투여하기 위해 두 개의 독립적인 복강 내 카테터를 삽입해야 합니다. 이 카테터들은 27 gauge 바늘과 유연한 실리콘 튜브로 조립합니다.

그 다음 시린지 펌프를 사용하여 주입을 시작합니다. 카테터를 뒷다리 근처의 하복부에 삽입합니다. 마우스에 생체 징후 모니터를 부착한 후, 1 XPBS에 3% aros 100 milliliters를 준비합니다.

aros가 41 °C로 식으면, 18 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지를 사용하여 간을 그 안에 매립합니다. aeros가 식은 후, heideman 스파출러를 사용하여 과잉분을 제거하고 간을 스캔하기에 충분한 시야를 확보합니다. 그런 다음 스캔을 진행합니다.

시야가 준비되면, 마우스를 현미경 아래로 이동시켜 타임랩스 이미징을 위한 적절한 스캐닝 영역을 선택합니다. 외부 백색 광원을 사용하여 간 조직을 육안으로 스캔함으로써, 충분한 혈류가 흐르고 샘플 섭동이 최소화된 대표적인 영역을 식별합니다. CXCR6 GFP 이형접합체 마우스를 대상으로 생체 내 T-P-L-S-M 이미징 실험을 수행하였습니다. 일부 마우스에는 급성 간 손상을 유도하기 위해 사염화탄소를 복강 내로 주입하였습니다.

GFP를 발현하는 Modal 세포를 비디오로 추적하고, 세포 이동성의 스냅샷을 얻기 위해 해당 경로를 중첩시켰습니다. 그 후 경로를 정규화했습니다. 정상 간에서는 세포들이 무작위 이동 패턴을 보였습니다.

CCI four를 주입한 간에서는 세포 이동의 손상이 나타났습니다. 기점으로부터의 총 변위를 측정한 결과, CCI four 처리 36시간 후 간세포 손상 부위에서 세포 포착 현상이 있음이 분명하게 드러났습니다. 간 손상으로 인한 이동성 저하는 개별 세포의 시간에 따른 이동 속도를 그래프로 그려 확인했으며, 18시간 후 부분적인 정지와 36시간 후 완전한 이동 정지가 나타났습니다.

세포 집단으로서 비교했을 때, 이동하는 세포의 속도 감소 또한 통계적으로 유의미한 것으로 나타날 수 있습니다. 따라서 이 접근 방식은 진행 중인 간 질환에서 세포 이동 및 위치 변화를 추적하는 데 적합합니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 내 다광자 현미경 관찰을 위한 마우스 간 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

본 연구에서 제공하는 방법은 온화한 고정법을 통해 동물의 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화할 뿐만 아니라, 장기 생존을 위해 동물을 안정화할 수 있게 해줍니다. 마취가 완료되면, 적절히 수행될 경우 이 기술은 약 1시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 과정 동안 체온, 심박수, 산소 및 CO2 수치와 같은 동물의 생체 지표를 제어하는 것이 중요합니다. 이는 마취 깊이와 호흡을 조절함으로써 달성할 수 있습니다.

침윤된 면역 세포의 표현형이나 조직 및 침윤 세포에서 분비되는 매개체와 같은 추가적인 의문점을 해결하기 위해 유세포 분석이나 레이저 캡처 미세 절단(laser capture micro dissection)과 같은 다른 절차를 수행할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 연구자들은 간 내 백혈구 이동의 역학과 세포 간 상호작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있었으며, 염증성 간 질환으로 이어지는 일련의 사건들을 분석할 수 있었습니다. 다광자 현미경에 사용되는 고에너지 펄스 적외선 레이저로 이미징을 수행할 때는 레이저 안전 지침을 준수하시기 바랍니다.

본 실험을 수행하는 동안 레이저 방사선의 반사로 인해 눈과 피부에 위험이 발생하지 않도록 주의하십시오.