Name: Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Découvrez comment quantifier les forces de protrusion des podosomes par microscopie à force atomique. Cette méthode mesure la déformation d'un film souple pour évaluer les forces cellulaires et mieux comprendre la mécanique de l'adhésion.

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Les auteurs sont reconnaissants envers Anna Labernadie, Guillaume Charrière et Patrick Delobelle pour leur contribution initiale à ce travail et à Matthieu Sanchez et Françoise Viala pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage. Ce travail a été soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer et Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. préparation des grilles Formvar-enduit
<ol><li>Nettoyer les grilles de la microscopie électronique avec de l’acétone pur et séchez-les sur du papier filtre. Puis nettoyez avec de l’éthanol pur, une lame de microscope, essuyer avec un papier de lentille et enlever la poussière avec un ventilateur.</li>
	<li>Placez une lamelle de verre nettoyé à l’éthanol verticalement dans l’entonnoir d’un film de dispositif de moulage contenant une solution de Formvar dans la partie inférieure. Recouvrir le haut de l’entonnoir.</li>
	<li>100 mL de solution de Formvar (0,5 % en chlorure d’éthylène) la pompe avec la poire atomiseur jusqu'à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive.</li>
	<li>Garder la lame dans la solution pendant 1 min.</li>
	<li>Ouvrez le robinet de l’appareil pour vider la solution Formvar dans un flot continu. Un débit de 10 à 15 mL/s produira un film Formvar de 30 à 80 nm. L’épaisseur du film est déterminée par la concentration de la solution de Formvar et par le débit de drainage. Remarque : Le débit de drainage peut être contrôlé par la pression par la soupape d’air sortie d’évacuation en ouvrant lentement le robinet. Plus vite le drainage, le plus épais du film. Dans la pratique, parce qu’il est difficile de prévoir l’épaisseur de la couche de la vitesse d’écoulement de Formvar, nous préparons plusieurs lots de Formvar films et contrôler leur épaisseur par AFM (voir étape 2).</li>
	<li>Retirez la lame de la chambre et séchez-le délicatement sur un papier filtre pour enlever n’importe quel liquide Formvar.</li>
	<li>Découper un rectangle de 20 x 50 mm du film Formvar avec une lame de rasoir.</li>
	<li>Remplir un bécher d’eau distillée et lentement plonger la lame verticalement dans l’eau à flotter sur le film : le film devrait flotter à la surface de l’eau.</li>
	<li>Relever le lieu nettoyé à l’acétone secs grilles sur le film, brillant.</li>
	<li>Placez une lamelle de verre rond (Ø 12 mm) sur quelques uns des grilles. Cette lamelle servira à mesurer l’épaisseur de film (voir étape 2).</li>
	<li>Couvrir une lame de microscope avec un autocollant blanc redimensionné pour s’adapter à elle. Tremper la lame verticalement à la frontière du film Formvar flottant jusqu'à ce que tout le film adhère à la diapositive. Retirer l’eau en excès de la diapositive avec le papier filtre et laisser sécher à température ambiante pendant la nuit.</li>
</ol>2. mesure de l’épaisseur du Film
<ol><li>Couper le Formvar autour de la lamelle couvre-objet avec la pince à épiler pour détacher de la diapositive.</li>
	<li>Marquer l’emplacement de la grille sous la lamelle avec un stylo.</li>
	<li>Couper le Formvar autour de la grille marquée pour détacher de la lamelle. Il y aura donc un trou dans la feuille de Formvar restante, qui permettra de mesurer l’épaisseur du film. Couvrir la lamelle avec du PBS et le placer sur une lame de verre sur le microscope.</li>
	<li>Monter un cantilever de nitrure de silicium sur la brique de verre AFM, veillant à ce que la bande d’or n’est pas couvert par l’extrémité du ressort. Remarque : La sensibilité et la constante du ressort du levier doivent ont précédemment été calibrés dans du PBS.</li>
	<li>Monter la brique de verre sur le module de l’AFM et ensuite placer le module sur le microscope.</li>
	<li>Placer la lamelle Formvar-enduit à la chambre d’observation et la couvrir avec 500 µL de PBS.</li>
	<li>Scan de la frontière du trou dans la feuille de Formvar utilisant l’AFM dans le mode de contact et un point de consigne de force nN 0,5.</li>
	<li>Utilisez la surface de lamelle de verre comme référence pour les mesures de hauteur et d’évaluer l’épaisseur de Formvar comme la hauteur de la section transversale (mesurer au moins 10 par Formvar lot).</li>
</ol>3. ensemencement de cellules sur des grilles
<ol><li>Sous hotte stérile, mettre une bande (12 x 3 mm) de ruban adhésif double-face sur un lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Découper une grille Formvar-enduit avec des pincettes et mettez-le à l’envers sur la bande adhésive (seulement la jante de la grille doit être attachée à la bande). Le film de Formvar doit faire face à la lamelle.</li>
	<li>Mettre cet appareil dans une culture bien.</li>
	<li>Placer une goutte de 10 µL de RPMI sans FCS contenant 104 macrophages différenciés des monocytes humains16. Remarque : Veillez à ne pas toucher la grille avec l’embout de la pipette pour éviter d’endommager le revêtement Formvar.</li>
	<li>Incuber 30 min (37 ° C, 5 % de CO2) pour laisser les cellules adhèrent.</li>
	<li>Remplir le puits avec 2 mL de RPMI contenant 10 % FCS.</li>
	<li>Incuber le dispositif pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2 à laisser les cellules à respecter avant l’observation de l’AFM.</li>
</ol>4. topographie mesures de déformations induites par le podosomes
<ol><li>Coller deux bandes de ruban adhésif double-face sur un fond de verre plat de Pétri. Remarque : La distance entre les deux bandes doit être inférieure au diamètre de la grille.</li>
	<li>Soigneusement détacher la grille plaquée avec du ruban adhésif, les macrophages.</li>
	<li>Renversez la grille afin d’avoir des cellules face à la vitre et le bâton de la grille se trouvant entre les deux bandes adhésives.</li>
	<li>Fixer la grille avec deux nouvelles bandes d’adhésif double-face : la grille sera ainsi intercalée entre deux bandes adhésives, laissant la zone centrale de la grille accessible à la pointe de l’AFM. Remarque : Assurez-vous que la grille soit bien fixée et pas tordue ; sinon le cantilever AFM ne peut-être pas en mesure d’approcher la surface Formvar.</li>
	<li>Remplissez la boîte de Pétri avec 2 mL de milieu de culture préchauffé 37 ° C (RPMI avec 10 % FCS) additionné de 10 mM HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>Placez la boîte de Petri sur un chauffe plat de 37 ° C.</li>
	<li>Installer l’appareil à plat sur la scène de l’AFM.</li>
	<li>Laisser le système se stabiliser à 37 ° C.</li>
	<li>En mode de contact avec une force nN 0,5, faire une première image globale pour localiser les podosomes et puis analyser la topographie Formvar à 3 Hz avec un pixel environ 20 nm-grand. NOTE : Éviter d’analyser près des bords de la grille.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
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<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
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<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Propriétés des matériaux
Le choix du matériau de la membrane déformable, dans notre cas Formvar, il faut remplir quelques conditions. Le matériel doit être transparent à la lumière visible et fluorescence auto limitée pour permettre des observations dans le champ lumineux et la microscopie de fluorescence. La rugosité de la couche mince doit être bien inférieure à 10 nm pour éviter tout effet topographique sur l’adhérence des cellules et permettre à claire observation des prot...

Les cellules animales interagissent physiquement avec la matrice et les autres cellules qui constituent leur environnement1. Cela est nécessaire à leur migration, internaliser les organes, acquérir de l’information externe ou différencier. Dans ces processus, la cellule doit générer des forces mécaniques et, comme de nombreuses études ont montré ces dernières années, la capacité d’une cellule pour générer des forces et sonde son environnement influe sur son comportement biologique, mise en scène par exemple prolifération ou différenciation2,3. À son tour, la mesure des forces cellulaires est une aide importante pour étudier la régulation de la production de force et de comprendre son implication dans la cellule comportement et tissu sort4,5.
Ces dernières années ont vu le développement de nombreuses techniques pour mesurer les forces qu’une cellule peut exercer sur son environnement6. La majorité d'entre eux ont contribué à révéler que la traction des forces que les cellules exercent comme ils tirent sur les sondes mobiles ou un substrat déformable. Cependant, les forces mécaniques impliquées en saillie dans l’environnement extracellulaire souffrent d’un manque de techniques de mesure et sont à ce jour n’est pas bien caractérisé.
Pour contourner cette limitation, nous présentons une méthode pour mesurer les forces exercées perpendiculairement au substrat. Il consiste en la plaquant sur une mince feuille élastique qui peut se déformer dans la direction orthogonale, ce qui permet de mesurer la déformation du substrat par les cellules et en déduire les forces en présence, les cellules vivantes. Topographie de substrat est mesurée à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide de la microscopie à force atomique et de l’évaluation des forces de déformation s’appuie sur la connaissance de la géométrie des structures cellulaires protrusive7,8, 9.
Nous décrivons ici le programme d’installation et de son application pour mesurer les forces générées par les podosomes, structures d’adhérence protrusive formés par les macrophages pour leur migration mésenchymateuse dans des environnements en trois dimensions10,11, 12,13,14,15,16,17. Nous pensons que cette technique fera progresser la compréhension de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie.

<table><tbody><tr><td>Grilles de nickel 200 mailles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Autocollants blancs 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de coulée de film avec valve dans sa sortie</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar solution à 0,5 % dans du dichlorure d’éthylène</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon à température contrôlée&nbsp ;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Carbure de silicium en porte-à-faux avec une constante de ressort nominale de 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri à fond en verre 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie à force saillie : une méthode pour quantifier les forces développées par cellule saillies

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Dans nombreux contextes biologiques, cellules animales ont besoin d’interagir physiquement avec leur environnement en développant des forces mécaniques. Parmi ceux-ci, les forces de traction ont été bien caractérisés, mais il y a un manque de techniques permettant de mesurer les forces de protrusion exercée par les cellules orthogonalement à leur substrat. Nous avons conçu un montage expérimental pour mesurer les forces de protrusion exercées par les cellules adhérentes sur leur substrat. Les cellules plaqués sur une feuille de Formvar conforme déforment ce substrat et la topographie qui en résulte est mappée par microscopie à force atomique (AFM) à l’échelle du nanomètre. Valeurs de force sont alors extraites de l’analyse de la déformation de profil basé sur la géométrie des structures cellulaires protrusive. Par conséquent, les forces exercées par les différentes unités qui dépasse d’une cellule vivante peuvent être mesurées au fil du temps. Cette technique va permettre l’étude de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie. Nous décrivons ici son application pour mesurer les forces protrusive générés par podosomes formé par les macrophages humains.

Le protocole ci-dessus décrit comment préparer le montage expérimental de quantifier protrusion forces exercées par les macrophages podosomes sur un substrat de Formvar. Ceci est réalisé en utilisant le manuel de vol et est illustrée à la Figure 1.
Lorsqu’on analyse une image topographique des renflements sous podosomes en utilisant le logiciel de traitement de données JPK, un polynôme du troisième ...

Ici, nous détaillons les techniques expérimentales utilisées pour évaluer les forces de protrusion podosomes applicables sur un film compatible, de la préparation du film pour l’analyse automatique des images topographiques.

Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les forces de saillie à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord les grilles revêtues de la formule et de mesurer l’épaisseur de ce film. La troisième étape de ce processus consiste à placer les cellules sur les grilles et à les laisser adhérer.La dernière étape de la procédure consiste à imager le film forma sous les cellules à l’aide de la microscopie à force atomique. Lorsqu’ils adhèrent au substrat, les microphages forment des structures d’adhésion submicrométriques appelées podosomes. À terme, la déformation du film utilisé par les podosomes sera quantifiée et convertie en forces à l’aide d’un modèle mécanique fait maison.Placez une lampe en verre propre à l’éthanol dans le dispositif de coulée de film d’entonnoir et couvrez le haut de l’entonnoir. Faites pivoter la solution de fomvar dans l’entonnoir jusqu’à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive. Laissez-le agir pendant une minute puis égouttez la solution de formvar en un jet régulier.Notez que l’épaisseur du film dépend à la fois du débit d’écoulement et de la concentration de la solution de formvar. Tapotez cette lumière pour l’assécher foncée et découpez des rectangles avec une lame de rasoir tranchante. Trempez la lame dans votre bécher rempli d’eau distillée afin que le film fomvar flotte à la surface de l’eau.Placez soigneusement des grilles propres à l’acétone sur les films, face brillante vers le haut avec une gaine de 12 millimètres de diamètre sur certains d’entre eux. Ils seront utilisés pour l’expérience d’évaluation de l’épaisseur. Trempez éventuellement une diapositive recouverte d’autocollants pour récupérer l’ensemble du film et des grilles.Tracez le contour de la lamelle recouverte de verre à l’aide d’une pince à épiler pour couper le formvar et le détacher de la diapositive. Fixez l’emplacement de la grille sous le slip couvert, puis tracez le contour de la grille avec une pince à épiler pour la retirer. Le trou dans le film fomvar ainsi créé sera imagé pour mesurer son épaisseur.Montez un filet de nitrate de silicium dans le bloc de verre AFM en vous assurant que la bande dorée n’est pas sous l’extrémité du ressort. Montez la brique de verre sur le module AFM, puis placez ce dernier sur la platine du microscope. Placez la lamelle de recouvrement enduite de fomvar sur la chambre d’observation avec le PBS sur le dessus.Scannez la frontière entre le fomvar et le verre en mode contact et avec un point de 0,5 nano newton. Dans le logiciel de traitement des données, utilisez la surface du verre comme référence de hauteur et mesurez l’épaisseur du verre sur la section transversale. Sous une hotte stérile, prélevez une gaine de 12 millimètres et collez-y une bande de ruban adhésif à trous.Tracez le contour de la grille enduite de fomavr avec une pince à épiler et placez-la brillante face vers le haut afin qu’elle ne se fixe que sur les côtés de l’adhésif. Il s’agit d’éviter que le fomvar ne se déchire lors du retrait de la grille de la bande. Placez la bande de couverture dans une plaque stérile à six puits et versez une gouttelette de 10 millimètres de milieu de culture sans sérum.Il devrait contenir environ 10 000 cellules et dans ce cas, il s’agit de microphages différenciés des monocytes humains. Assurez-vous de ne pas toucher la grille avec la pointe du cornemuse dans le processus, afin de ne pas endommager le revêtement du fomvar. Incuber pendant une demi-heure pour laisser les cellules adhérer, puis remplir le puits avec un milieu supplémenté en sérum, et incuber à nouveau pendant deux heures, avant l’observation de l’AFM.Placez deux bandes parallèles de ruban adhésif double face sur une boîte de Pétri à fond de verre, en vous assurant que la largeur entre elles est légèrement plus petite par rapport au diamètre de votre grille. Ensuite, détachez la grille précédemment ensemencée avec des cellules et placez-la sur les deux bandes de ruban avec les cellules vers le bas. Fixez la grille en plaçant deux autres bandes sur les précédentes.Remplissez le plat d’un milieu de culture préchauffé complété par de l’hepe’s. Placez le plat dans le chauffe-vaisselle préalablement réglé à 37 degrés Celsius. Installez l’ensemble sur la scène AFM.Lorsque la température du système est stable à 37 degrés Celsius, procédez au balayage de la surface du fomvar, qui doit être effectué en mode contact, avec un point de consigne de 0,95 nano newton et visualisez les déformations associées aux protozoaires sur la fenêtre de visualisation des données de déflexion. Voici les résultats représentatifs et les étapes de traitement pour donner des formations avec AFM aux mesures graphiques. Comme vous pouvez le voir sur cette image, des renflements sur la surface du fomvar sont détectés.Afin de convertir ces informations photographiques en valeurs de force, il est nécessaire d’avoir d’abord accès à la différence élevée locale. Pour ce faire, un ajustement polynomial du troisième degré doit être soustrait à sa ligne de balayage indépendamment. Ensuite, l’utilisation d’un algorithme d’imagerie dédié fait maison permet d’évaluer les valeurs de force de saillie à partir de la carte de hauteur AFM et du modèle mécanique de la saillie médiée par les protozoaires.Grâce à cette procédure, nous sommes en mesure d’étudier les mécanismes impliqués dans la génération de la force de saillie chez les protozoaires. Merci d’avoir regardé, et bonne chance pour vos expériences.

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