Name: Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Découvrez comment quantifier les forces de protrusion des podosomes par microscopie à force atomique. Cette méthode mesure la déformation d'un film souple pour évaluer les forces cellulaires et mieux comprendre la mécanique de l'adhésion.

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Les auteurs sont reconnaissants envers Anna Labernadie, Guillaume Charrière et Patrick Delobelle pour leur contribution initiale à ce travail et à Matthieu Sanchez et Françoise Viala pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage. Ce travail a été soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer et Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. préparation des grilles Formvar-enduit
<ol><li>Nettoyer les grilles de la microscopie électronique avec de l’acétone pur et séchez-les sur du papier filtre. Puis nettoyez avec de l’éthanol pur, une lame de microscope, essuyer avec un papier de lentille et enlever la poussière avec un ventilateur.</li>
	<li>Placez une lamelle de verre nettoyé à l’éthanol verticalement dans l’entonnoir d’un film de dispositif de moulage contenant une solution de Formvar dans la partie inférieure. Recouvrir le haut de l’entonnoir.</li>
	<li>100 mL de solution de Formvar (0,5 % en chlorure d’éthylène) la pompe avec la poire atomiseur jusqu'à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive.</li>
	<li>Garder la lame dans la solution pendant 1 min.</li>
	<li>Ouvrez le robinet de l’appareil pour vider la solution Formvar dans un flot continu. Un débit de 10 à 15 mL/s produira un film Formvar de 30 à 80 nm. L’épaisseur du film est déterminée par la concentration de la solution de Formvar et par le débit de drainage. Remarque : Le débit de drainage peut être contrôlé par la pression par la soupape d’air sortie d’évacuation en ouvrant lentement le robinet. Plus vite le drainage, le plus épais du film. Dans la pratique, parce qu’il est difficile de prévoir l’épaisseur de la couche de la vitesse d’écoulement de Formvar, nous préparons plusieurs lots de Formvar films et contrôler leur épaisseur par AFM (voir étape 2).</li>
	<li>Retirez la lame de la chambre et séchez-le délicatement sur un papier filtre pour enlever n’importe quel liquide Formvar.</li>
	<li>Découper un rectangle de 20 x 50 mm du film Formvar avec une lame de rasoir.</li>
	<li>Remplir un bécher d’eau distillée et lentement plonger la lame verticalement dans l’eau à flotter sur le film : le film devrait flotter à la surface de l’eau.</li>
	<li>Relever le lieu nettoyé à l’acétone secs grilles sur le film, brillant.</li>
	<li>Placez une lamelle de verre rond (Ø 12 mm) sur quelques uns des grilles. Cette lamelle servira à mesurer l’épaisseur de film (voir étape 2).</li>
	<li>Couvrir une lame de microscope avec un autocollant blanc redimensionné pour s’adapter à elle. Tremper la lame verticalement à la frontière du film Formvar flottant jusqu'à ce que tout le film adhère à la diapositive. Retirer l’eau en excès de la diapositive avec le papier filtre et laisser sécher à température ambiante pendant la nuit.</li>
</ol>2. mesure de l’épaisseur du Film
<ol><li>Couper le Formvar autour de la lamelle couvre-objet avec la pince à épiler pour détacher de la diapositive.</li>
	<li>Marquer l’emplacement de la grille sous la lamelle avec un stylo.</li>
	<li>Couper le Formvar autour de la grille marquée pour détacher de la lamelle. Il y aura donc un trou dans la feuille de Formvar restante, qui permettra de mesurer l’épaisseur du film. Couvrir la lamelle avec du PBS et le placer sur une lame de verre sur le microscope.</li>
	<li>Monter un cantilever de nitrure de silicium sur la brique de verre AFM, veillant à ce que la bande d’or n’est pas couvert par l’extrémité du ressort. Remarque : La sensibilité et la constante du ressort du levier doivent ont précédemment été calibrés dans du PBS.</li>
	<li>Monter la brique de verre sur le module de l’AFM et ensuite placer le module sur le microscope.</li>
	<li>Placer la lamelle Formvar-enduit à la chambre d’observation et la couvrir avec 500 µL de PBS.</li>
	<li>Scan de la frontière du trou dans la feuille de Formvar utilisant l’AFM dans le mode de contact et un point de consigne de force nN 0,5.</li>
	<li>Utilisez la surface de lamelle de verre comme référence pour les mesures de hauteur et d’évaluer l’épaisseur de Formvar comme la hauteur de la section transversale (mesurer au moins 10 par Formvar lot).</li>
</ol>3. ensemencement de cellules sur des grilles
<ol><li>Sous hotte stérile, mettre une bande (12 x 3 mm) de ruban adhésif double-face sur un lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Découper une grille Formvar-enduit avec des pincettes et mettez-le à l’envers sur la bande adhésive (seulement la jante de la grille doit être attachée à la bande). Le film de Formvar doit faire face à la lamelle.</li>
	<li>Mettre cet appareil dans une culture bien.</li>
	<li>Placer une goutte de 10 µL de RPMI sans FCS contenant 104 macrophages différenciés des monocytes humains16. Remarque : Veillez à ne pas toucher la grille avec l’embout de la pipette pour éviter d’endommager le revêtement Formvar.</li>
	<li>Incuber 30 min (37 ° C, 5 % de CO2) pour laisser les cellules adhèrent.</li>
	<li>Remplir le puits avec 2 mL de RPMI contenant 10 % FCS.</li>
	<li>Incuber le dispositif pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2 à laisser les cellules à respecter avant l’observation de l’AFM.</li>
</ol>4. topographie mesures de déformations induites par le podosomes
<ol><li>Coller deux bandes de ruban adhésif double-face sur un fond de verre plat de Pétri. Remarque : La distance entre les deux bandes doit être inférieure au diamètre de la grille.</li>
	<li>Soigneusement détacher la grille plaquée avec du ruban adhésif, les macrophages.</li>
	<li>Renversez la grille afin d’avoir des cellules face à la vitre et le bâton de la grille se trouvant entre les deux bandes adhésives.</li>
	<li>Fixer la grille avec deux nouvelles bandes d’adhésif double-face : la grille sera ainsi intercalée entre deux bandes adhésives, laissant la zone centrale de la grille accessible à la pointe de l’AFM. Remarque : Assurez-vous que la grille soit bien fixée et pas tordue ; sinon le cantilever AFM ne peut-être pas en mesure d’approcher la surface Formvar.</li>
	<li>Remplissez la boîte de Pétri avec 2 mL de milieu de culture préchauffé 37 ° C (RPMI avec 10 % FCS) additionné de 10 mM HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>Placez la boîte de Petri sur un chauffe plat de 37 ° C.</li>
	<li>Installer l’appareil à plat sur la scène de l’AFM.</li>
	<li>Laisser le système se stabiliser à 37 ° C.</li>
	<li>En mode de contact avec une force nN 0,5, faire une première image globale pour localiser les podosomes et puis analyser la topographie Formvar à 3 Hz avec un pixel environ 20 nm-grand. NOTE : Éviter d’analyser près des bords de la grille.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
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<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
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<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
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<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Propriétés des matériaux
Le choix du matériau de la membrane déformable, dans notre cas Formvar, il faut remplir quelques conditions. Le matériel doit être transparent à la lumière visible et fluorescence auto limitée pour permettre des observations dans le champ lumineux et la microscopie de fluorescence. La rugosité de la couche mince doit être bien inférieure à 10 nm pour éviter tout effet topographique sur l’adhérence des cellules et permettre à claire observation des prot...

Les cellules animales interagissent physiquement avec la matrice et les autres cellules qui constituent leur environnement1. Cela est nécessaire à leur migration, internaliser les organes, acquérir de l’information externe ou différencier. Dans ces processus, la cellule doit générer des forces mécaniques et, comme de nombreuses études ont montré ces dernières années, la capacité d’une cellule pour générer des forces et sonde son environnement influe sur son comportement biologique, mise en scène par exemple prolifération ou différenciation2,3. À son tour, la mesure des forces cellulaires est une aide importante pour étudier la régulation de la production de force et de comprendre son implication dans la cellule comportement et tissu sort4,5.
Ces dernières années ont vu le développement de nombreuses techniques pour mesurer les forces qu’une cellule peut exercer sur son environnement6. La majorité d'entre eux ont contribué à révéler que la traction des forces que les cellules exercent comme ils tirent sur les sondes mobiles ou un substrat déformable. Cependant, les forces mécaniques impliquées en saillie dans l’environnement extracellulaire souffrent d’un manque de techniques de mesure et sont à ce jour n’est pas bien caractérisé.
Pour contourner cette limitation, nous présentons une méthode pour mesurer les forces exercées perpendiculairement au substrat. Il consiste en la plaquant sur une mince feuille élastique qui peut se déformer dans la direction orthogonale, ce qui permet de mesurer la déformation du substrat par les cellules et en déduire les forces en présence, les cellules vivantes. Topographie de substrat est mesurée à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide de la microscopie à force atomique et de l’évaluation des forces de déformation s’appuie sur la connaissance de la géométrie des structures cellulaires protrusive7,8, 9.
Nous décrivons ici le programme d’installation et de son application pour mesurer les forces générées par les podosomes, structures d’adhérence protrusive formés par les macrophages pour leur migration mésenchymateuse dans des environnements en trois dimensions10,11, 12,13,14,15,16,17. Nous pensons que cette technique fera progresser la compréhension de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie.

<table><tbody><tr><td>Grilles de nickel 200 mailles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Autocollants blancs 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de coulée de film avec valve dans sa sortie</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar solution à 0,5 % dans du dichlorure d’éthylène</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon à température contrôlée&nbsp ;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Carbure de silicium en porte-à-faux avec une constante de ressort nominale de 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri à fond en verre 35 mm</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie à force saillie : une méthode pour quantifier les forces développées par cellule saillies

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Dans nombreux contextes biologiques, cellules animales ont besoin d’interagir physiquement avec leur environnement en développant des forces mécaniques. Parmi ceux-ci, les forces de traction ont été bien caractérisés, mais il y a un manque de techniques permettant de mesurer les forces de protrusion exercée par les cellules orthogonalement à leur substrat. Nous avons conçu un montage expérimental pour mesurer les forces de protrusion exercées par les cellules adhérentes sur leur substrat. Les cellules plaqués sur une feuille de Formvar conforme déforment ce substrat et la topographie qui en résulte est mappée par microscopie à force atomique (AFM) à l’échelle du nanomètre. Valeurs de force sont alors extraites de l’analyse de la déformation de profil basé sur la géométrie des structures cellulaires protrusive. Par conséquent, les forces exercées par les différentes unités qui dépasse d’une cellule vivante peuvent être mesurées au fil du temps. Cette technique va permettre l’étude de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie. Nous décrivons ici son application pour mesurer les forces protrusive générés par podosomes formé par les macrophages humains.

Le protocole ci-dessus décrit comment préparer le montage expérimental de quantifier protrusion forces exercées par les macrophages podosomes sur un substrat de Formvar. Ceci est réalisé en utilisant le manuel de vol et est illustrée à la Figure 1.
Lorsqu’on analyse une image topographique des renflements sous podosomes en utilisant le logiciel de traitement de données JPK, un polynôme du troisième ...

Ici, nous détaillons les techniques expérimentales utilisées pour évaluer les forces de protrusion podosomes applicables sur un film compatible, de la préparation du film pour l’analyse automatique des images topographiques.

Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les forces de saillie à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord les grilles revêtues de la formule et de mesurer l’épaisseur de ce film. La troisième étape de ce processus consiste à placer les cellules sur les grilles et à les laisser adhérer.La dernière étape de la procédure consiste à imager le film forma sous les cellules à l’aide de la microscopie à force atomique. Lorsqu’ils adhèrent au substrat, les microphages forment des structures d’adhésion submicrométriques appelées podosomes. À terme, la déformation du film utilisé par les podosomes sera quantifiée et convertie en forces à l’aide d’un modèle mécanique fait maison.Placez une lampe en verre propre à l’éthanol dans le dispositif de coulée de film d’entonnoir et couvrez le haut de l’entonnoir. Faites pivoter la solution de fomvar dans l’entonnoir jusqu’à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive. Laissez-le agir pendant une minute puis égouttez la solution de formvar en un jet régulier.Notez que l’épaisseur du film dépend à la fois du débit d’écoulement et de la concentration de la solution de formvar. T

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Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d'actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode d’une micropipette pour appliquer directement une force contrôlée dans le noyau dans une cellule vivante. Ce dosage permet aux interrogatoires des propriétés mécaniques nucléaires dans la cellule vivante, adhérente.

Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

Ce protocole fournit des instructions pour la mise en œuvre de la lithographie multiphoton pour fabriquer des tableaux tridimensionnels de marqueurs fiducial fluorescents intégrés dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) pour une utilisation comme microscopie sans force de traction sans référence. Plates-formes. À l'aide de ces instructions, la mesure de la souche de matériau 3D et le calcul des tractions cellulaires sont simplifiés afin de promouvoir des mesures de la force de...

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Ici, nous présentons un protocole utilisé pour effectuer des expériences de microscopie de force de traction sur les cellules B. Nous décrivons la préparation de gels polyacrylamides mous et leur fonctionnalisation, ainsi que l’acquisition de données au microscope et un résumé de l’analyse des données.

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

La plate-forme iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatise le processus de mesure simultanée d’une grande variété de signaux chimiques et mécaniques dans les cellules adhérentes. iTACS est conçu pour faciliter le développement communautaire et permettre aux chercheurs d’utiliser toutes les fonctionnalités de la plate-forme, quel que soit leur niveau de formation.

Boîte à outils intégrative pour analyser les signaux cellulaires: forces, mouvement, morphologie et fluorescence

Ce protocole vise à mesurer les paramètres dynamiques (protubérances, rétractions, volants) des protubérances au bord des cellules étalées.

Mesure de la dynamique de la saillie du bord cellulaire pendant la propagation à l’aide de la microscopie à cellules vivantes

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Découvrez comment quantifier les forces de protrusion des podosomes par microscopie à force atomique. Cette méthode mesure la déformation d'un film souple pour évaluer les forces cellulaires et mieux comprendre la mécanique de l'adhésion.

Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

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