Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

L’objectif général de cette procédure est de quantifier les forces de saillie à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord les grilles revêtues de la formule et de mesurer l’épaisseur de ce film. La troisième étape de ce processus consiste à placer les cellules sur les grilles et à les laisser adhérer.

La dernière étape de la procédure consiste à imager le film forma sous les cellules à l’aide de la microscopie à force atomique. Lorsqu’ils adhèrent au substrat, les microphages forment des structures d’adhésion submicrométriques appelées podosomes. À terme, la déformation du film utilisé par les podosomes sera quantifiée et convertie en forces à l’aide d’un modèle mécanique fait maison.

Placez une lampe en verre propre à l’éthanol dans le dispositif de coulée de film d’entonnoir et couvrez le haut de l’entonnoir. Faites pivoter la solution de fomvar dans l’entonnoir jusqu’à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive. Laissez-le agir pendant une minute puis égouttez la solution de formvar en un jet régulier.

Notez que l’épaisseur du film dépend à la fois du débit d’écoulement et de la concentration de la solution de formvar. Tapotez cette lumière pour l’assécher foncée et découpez des rectangles avec une lame de rasoir tranchante. Trempez la lame dans votre bécher rempli d’eau distillée afin que le film fomvar flotte à la surface de l’eau.

Placez soigneusement des grilles propres à l’acétone sur les films, face brillante vers le haut avec une gaine de 12 millimètres de diamètre sur certains d’entre eux. Ils seront utilisés pour l’expérience d’évaluation de l’épaisseur. Trempez éventuellement une diapositive recouverte d’autocollants pour récupérer l’ensemble du film et des grilles.

Tracez le contour de la lamelle recouverte de verre à l’aide d’une pince à épiler pour couper le formvar et le détacher de la diapositive. Fixez l’emplacement de la grille sous le slip couvert, puis tracez le contour de la grille avec une pince à épiler pour la retirer. Le trou dans le film fomvar ainsi créé sera imagé pour mesurer son épaisseur.

Montez un filet de nitrate de silicium dans le bloc de verre AFM en vous assurant que la bande dorée n’est pas sous l’extrémité du ressort. Montez la brique de verre sur le module AFM, puis placez ce dernier sur la platine du microscope. Placez la lamelle de recouvrement enduite de fomvar sur la chambre d’observation avec le PBS sur le dessus.

Scannez la frontière entre le fomvar et le verre en mode contact et avec un point de 0,5 nano newton. Dans le logiciel de traitement des données, utilisez la surface du verre comme référence de hauteur et mesurez l’épaisseur du verre sur la section transversale. Sous une hotte stérile, prélevez une gaine de 12 millimètres et collez-y une bande de ruban adhésif à trous.

Tracez le contour de la grille enduite de fomavr avec une pince à épiler et placez-la brillante face vers le haut afin qu’elle ne se fixe que sur les côtés de l’adhésif. Il s’agit d’éviter que le fomvar ne se déchire lors du retrait de la grille de la bande. Placez la bande de couverture dans une plaque stérile à six puits et versez une gouttelette de 10 millimètres de milieu de culture sans sérum.

Il devrait contenir environ 10 000 cellules et dans ce cas, il s’agit de microphages différenciés des monocytes humains. Assurez-vous de ne pas toucher la grille avec la pointe du cornemuse dans le processus, afin de ne pas endommager le revêtement du fomvar. Incuber pendant une demi-heure pour laisser les cellules adhérer, puis remplir le puits avec un milieu supplémenté en sérum, et incuber à nouveau pendant deux heures, avant l’observation de l’AFM.

Placez deux bandes parallèles de ruban adhésif double face sur une boîte de Pétri à fond de verre, en vous assurant que la largeur entre elles est légèrement plus petite par rapport au diamètre de votre grille. Ensuite, détachez la grille précédemment ensemencée avec des cellules et placez-la sur les deux bandes de ruban avec les cellules vers le bas. Fixez la grille en plaçant deux autres bandes sur les précédentes.

Remplissez le plat d’un milieu de culture préchauffé complété par de l’hepe’s. Placez le plat dans le chauffe-vaisselle préalablement réglé à 37 degrés Celsius. Installez l’ensemble sur la scène AFM.

Lorsque la température du système est stable à 37 degrés Celsius, procédez au balayage de la surface du fomvar, qui doit être effectué en mode contact, avec un point de consigne de 0,95 nano newton et visualisez les déformations associées aux protozoaires sur la fenêtre de visualisation des données de déflexion. Voici les résultats représentatifs et les étapes de traitement pour donner des formations avec AFM aux mesures graphiques. Comme vous pouvez le voir sur cette image, des renflements sur la surface du fomvar sont détectés.

Afin de convertir ces informations photographiques en valeurs de force, il est nécessaire d’avoir d’abord accès à la différence élevée locale. Pour ce faire, un ajustement polynomial du troisième degré doit être soustrait à sa ligne de balayage indépendamment. Ensuite, l’utilisation d’un algorithme d’imagerie dédié fait maison permet d’évaluer les valeurs de force de saillie à partir de la carte de hauteur AFM et du modèle mécanique de la saillie médiée par les protozoaires.

Grâce à cette procédure, nous sommes en mesure d’étudier les mécanismes impliqués dans la génération de la force de saillie chez les protozoaires. Merci d’avoir regardé, et bonne chance pour vos expériences.