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DOI: 10.3791/63819-v
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This study presents a method for reconstituting microtubule bundles in vitro to directly measure the forces exerted within these structures. Utilizing simultaneous optical trapping and total internal reflection fluorescence microscopy, the research enables nanoscale-level insights into the mechanical components of cells under various physiological conditions.
Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.
Notre protocole permet aux chercheurs de construire des motifs cytosquelettiques à partir de composants purifiés et de mesurer directement les forces générées par ces réseaux afin de comprendre comment ces composants mécaniques de la cellule fonctionnent à la fois dans les états sains et pathologiques. Cette méthode nous permet de quantifier les forces et de corréler ces chiffres directement pour conserver les paramètres des protéines impliquées, y compris la concentration et la densité des protéines. Paramètres généralement impossibles à acquérir au sein de la cellule.
Cette méthode peut fournir des informations sur tout type de réseau de cytosquelette, tels que ceux impliqués dans la mitose ou le développement neuronal. Il peut facilement être adapté pour étudier les réseaux impliqués dans la contraction musculaire ou la migration cellulaire en échangeant simplement ces protéines spécifiques utilisées. L’aspect le plus délicat de cette méthode est la coordination des différentes technologies, qui comprennent un piège optique à faisceau unique et un microscope TIRF.
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