Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Notre protocole permet aux chercheurs de construire des motifs cytosquelettiques à partir de composants purifiés et de mesurer directement les forces générées par ces réseaux afin de comprendre comment ces composants mécaniques de la cellule fonctionnent à la fois dans les états sains et pathologiques. Cette méthode nous permet de quantifier les forces et de corréler ces chiffres directement pour conserver les paramètres des protéines impliquées, y compris la concentration et la densité des protéines. Paramètres généralement impossibles à acquérir au sein de la cellule.

Cette méthode peut fournir des informations sur tout type de réseau de cytosquelette, tels que ceux impliqués dans la mitose ou le développement neuronal. Il peut facilement être adapté pour étudier les réseaux impliqués dans la contraction musculaire ou la migration cellulaire en échangeant simplement ces protéines spécifiques utilisées. L’aspect le plus délicat de cette méthode est la coordination des différentes technologies, qui comprennent un piège optique à faisceau unique et un microscope TIRF.

De plus, les expériences sur une seule molécule nécessitent une préparation minutieuse des surfaces, telles que la glissière de couverture, de sorte que la préparation d’échantillons de haute qualité est primordiale. Commencez par construire une chambre d’humidité en plaçant un mouchoir replié, non pelucheux, humidifié avec de l’eau ultrapure au fond d’une boîte de pointe de pipette vide. Introduisez tous les réactifs en pipetant le liquide à une extrémité du canal et en évacuant le liquide à l’extrémité opposée.

À l’aide d’une pointe de pipette inclinée de 20 microlitres, coulez lentement dans 10 microlitres de 0,5 milligramme par millilitre de streptavidine ou de NeutrAvidin. Incuber la lame dans la chambre d’humidité pendant 4 minutes avec le couvercle vers le bas. Rincez la chambre à l’aide de 20 microlitres d’un BRB80 1x à l’aide d’un mouchoir non pelucheux pour extraire les liquides.

Après avoir répété les réactifs à écoulement et l’incubation une fois de plus, rincer l’étape avec 10 microlitres de solution bloquante de caséine de 0,5 milligramme par millilitre. Écoulez 10 microlitres de microtubules biotinylés dilués dans la chambre, puis rincez la chambre avec 20 microlitres de 1x BRB80. Après avoir fait couler le réactif et incubé comme démontré précédemment, rincer l’étape avec 10 microlitres d’une concentration appropriée de protéine non motrice à étudier, puis couler dans 10 microlitres de microtubules de rhodamine et répéter l’incubation et le rinçage.

Ensuite, combinez 1 microlitre de billes enduites de kinésine de rigueur et 19 microlitres de tampon de réaction. Scellez les deux bords de la chambre avec du vernis à ongles transparent et attendez que le vernis sèche. Utiliser un instrument de microscope inversé qui a des capacités totales d’imagerie par fluorescence par réflexion interne et dans lequel un piège optique à faisceau unique a été construit.

Ajouter 1 goutte d’huile d’immersion sur le couvercle de la chambre d’échantillonnage. Avec le côté glissant du couvercle de la chambre d’échantillonnage vers le bas, placez l’échantillon à imager sur la plate-forme du microscope. Soulevez lentement l’objectif de manière à ce qu’il y ait un contact entre le couvercle et l’objectif à travers l’huile.

Ajustez la hauteur de l’objectif de sorte que la surface de glissement du couvercle de la chambre d’échantillonnage soit nette. Enregistrez des images mono-image des échantillons dans les trois canaux. Pour les expériences ici, utilisez 100 à 200 millisecondes d’exposition.

Ajustez la puissance du laser pour obtenir un bon rapport signal sur bruit à partir des échantillons tout en minimisant le blanchiment des photos sur 2 à 5 minutes lorsque le faisceau individuel est analysé. La fréquence des faisceaux de microtubules par champ de vision devrait être d’environ trois à quatre faisceaux de microtubules par 100 microlitres par champ de vision de 100 microlitres par chambre. Observez la densité des billes dans l’échantillon à l’aide d’un champ lumineux et de l’objectif 100x au microscope.

Utilisez une concentration de billes telle que les billes soient à au moins 10 micromètres les unes des autres en moyenne, et assurez-vous qu’elles sont exemptes de tout type de confinement de surface ou de regroupement. S’assurer que les microtubules rouge lointain biotinylés sont fermement attachés à la surface de la glissière de couverture et que la rhodamine ne présente aucun mouvement brownien visible. Assurez-vous que les microtubules de rhodamine sont attachés aux microtubules biotinylés via la carte de réticulation et qu’ils fluctuent visiblement à leurs extrémités libres.

Identifier un faisceau de microtubules approprié qui ne contient que deux microtubules, un biotinylé avec fixation pleine surface et un microtubule non biotinylé qui est partiellement libre en solution et est aligné sur l’axe x ou y. Utilisez le piège optique pour capturer une perle libre démontrant le mouvement brownien. Une fois que la perle a été piégée, déplacez soigneusement la perle sur le faisceau de microtubules sélectionné en vous assurant qu’aucune autre perle n’est tirée dans le piège dans le processus.

Assurez-vous que la bille est à plusieurs microns de la région de chevauchement contenant des protéines de réticulation. Abaissez délicatement la bille sur l’axe z jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le bord du segment libre du microtubule de rhodamine. Tirez doucement vers le haut et déplacez-vous perpendiculairement à l’axe du microtubule pour vérifier la fixation en observant la flexion du microtubule de rhodamine et en suivant la position du cordon.

Réalignez soigneusement le microtubule de rhodamine le long de l’axe du microtubule du microtubule fixé à la surface en déplaçant l’étape de nano-positionnement et configurez les paramètres pour le tirage automatisé du faisceau de microtubules. Réglez la direction le long de l’axe parallèle des microtubules. Définissez la vitesse de traction souhaitée et le temps de traction souhaité en fonction de la longueur de chevauchement.

Commencez à enregistrer les données de fluorescence dans les trois canaux à une vitesse de 1 à 2 images par seconde. Utilisez les puissances optimisées du laser et les temps d’exposition. Lancez le mouvement automatisé de la scène et enregistrez les données de piégeage à partir de l’étage du détecteur sensible à la position et de l’étage de la caméra à fluorescence par réflexion interne totale.

Désactivez les pièges pour libérer la perle et répétez l’expérience comme vous le souhaitez. Les ensembles de la protéine motrice mitotique essentielle kinesin-5 peuvent réguler le glissement des microtubules en générant à la fois des forces de poussée et de freinage qui évoluent linéairement avec la longueur de chevauchement. Il a été constaté que le domaine de queue C-terminal est nécessaire pour une réticulation et une génération de force efficaces.

La protéine pleine longueur est capable de générer des forces soutenues qui plafonnent lorsque toutes les protéines motrices atteignent leur force de décrochage individuelle. Cependant, le moteur kinesin-5 dépourvu de sa queue C-terminale génère des forces maximales dont l’amplitude est presque cinq fois plus petite. Les ensembles de la protéine mitotique non motrice PRC1 fonctionnent comme une nacelle mécanique pour résister au glissement des microtubules dans la zone médiane de la broche anaphasée.

Les forces résistives ne dépendent pas de la longueur des régions de chevauchement entre les paires de microtubules ou de la densité locale de réticulation, mais elles dépendent fortement de la concentration totale des molécules PRC1 engagées. Cette méthode peut être adaptée pour étudier divers systèmes biologiques tels que l’organisation microbienne et les neurones en utilisant des protéines alternatives. Il peut également être facilement étendu pour analyser les géométries de réseau à base d’actine afin d’étudier la contraction musculaire ou la motilité cellulaire.

Cette technique permet d’étudier des géométries totales cellulaires uniques, où les filaments sont à la fois de la piste et de la cargaison et sont organisés par de petits ensembles de protéines. Ces géométries imitent mieux ce qui se passe dans les cellules au cours de nombreux processus biologiques.