Name: Préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions Poussé par le démontage microtubules Ends (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Découvrez la préparation de microtubules sectoriels pour étudier les mouvements protéiques aux extrémités en dépolymérisation. Cette méthode utilise des chambres à flux et des capsules photoablatables pour un contrôle précis.

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Les auteurs tiennent à remercier FI Ataullakhanov pour aider à concevoir et fabriquer des chambres d&#39;écoulement réutilisables, N. Dachkevitch, N. et A. Gudimchuk Korbalev pour fournir des images de figures, N. et P. Gudimchuk Zakharov pour l&#39;élaboration d&#39;un protocole et de fournir des réactifs à préparer les graines des microtubules marquées à la digoxigénine, A. Potapenko de l&#39;aide pour l&#39;édition de texte et d&#39;autres membres de Grishchuk laboratoire pour obtenir des conseils et des discussions. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH GM R01-098 389 et une subvention pilote de Pennsylvanie Muscle Institut ELG, qui est un Kimmel Scholar, par RFBR accorde 12-04-00111-a, le 13-04-40190-H et 13 -04-40188-H, Académie russe des Sciences subventions Présidium (mécanismes de l&#39;intégration des systèmes moléculaires et les programmes de biologie cellulaire et moléculaire et moléculaires) à FI Ataullakhanov, NIH GM R01 GM033787 à JR McIntosh, et une bourse de recherche postdoctorale de la Fondation Dmitry dynastie Zimin à VAV

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

De nombreux essais de molécules simples de nos jours utilisent couramment des lamelles spécialement traitées pour réduire considérablement non spécifique de protéines de collage. La procédure que nous décrivons ici est une modification du protocole original développé en laboratoire Howard 32, et nous constatons que silaniser les lamelles vaut bien l&#39;effort même avec les dosages de perles à base de DIC, qui n&#39;utilisent pas de fluorescence. Chambers assemblés avec ces lamelles présentent des surfaces pl...

Les microtubules sont des structures hautement conservées du cytosquelette qui sont importants pour l&#39;architecture cellulaire, la motilité cellulaire, la division cellulaire, le transport intracellulaire et 1. Ces polymères dynamiques assembler à partir de tubuline en présence de GTP, et ils commutent spontanément entre la croissance et le raccourcissement 2. Les microtubules sont très mince (seulement 25 nm de diamètre) donc des techniques optiques spéciales pour renforcer le contraste doit être utilisé pour observer les microtubules avec un microscope optique. Les travaux antérieurs de ces polymères a examiné leur comportement dynamique utilisant contraste interférentiel différentiel (DIC) 3. Et d&#39;autres semblables études in vitro ont montré que dans des conditions expérimentales typiques, les microtubules subissent catastrophe et passer à la dépolymérisation que rarement, une fois tous les 5-15 min (cette fréquence est de 7-15 mM concentration de tubuline soluble examiné à 28-32 ° C ) 4. Différentes techniques ont ainsi été proposés à inductione dépolymérisation des microtubules d&#39;une manière contrôlée. Raccourcissement des microtubules peut être déclenché par élimination par lavage de la tubuline soluble 5,6, coupant microtubules avec un faisceau laser à 7, ou en utilisant des microtubules segmentées 8, comme décrit ici. Des travaux antérieurs utilisant microtubules segmentés, ainsi que les polymères de commutation stochastique, a trouvé que les petites cargaisons intracellulaires, comme les chromosomes, vésicules, et perles de revêtus de protéine, peuvent se déplacer à l&#39;extrémité des microtubules de raccourcissement 9-13. Ce phénomène est supposé avoir une incidence directe sur les mouvements des chromosomes dans les cellules en mitose, et les mécanismes sous-jacents sont actuellement sous enquête 14-16. Récemment, des techniques fluorescentes base, y compris la fluorescence totale interne de réflexion (FRBR) microscopie, ont été utilisées pour étudier la motilité de microtubules dynamique extrémités 17-24. L&#39;avantage de cette approche est qu&#39;elle permet l&#39;examen de l&#39;interactions entre les microtubules et les protéines des microtubules contraignant en temps réel à l&#39;aide de protéines marquées avec des fluorophores différents. Plusieurs complexes de protéines ont été trouvés pour déplacer processively avec allongement et / ou raccourcissement des extrémités des microtubules. Ils comprennent les protéines associées aux microtubules Dam1 10,12,18, SKA1 19, et XMAP215 20, ainsi que les moteurs de kinésine Kif18A 21,22, MCAK 23 et CENP-E 24. Ces protéines présentent pointe de suivi processive, qui est fondamentalement différente de celle des protéines de pointe de suivi classiques comme EB1 25. Bien que les molécules EB1 et les partenaires associés semblent rester stable associée à des microtubules dynamique se termine, les molécules individuelles restent liés à la pointe des microtubules pour seulement ~ 0,8 sec, échanger rapidement avec la piscine soluble 26. En revanche, la pointe des trackers processives, comme Dam1, voyagent avec des microtubules se termine pour beaucoup de microns, et leur association avec des conseils de microtubules peuvent durer mdes secondes. La pointe de temps de l&#39;association, ainsi que le taux de suivi résultant, dépend fortement du nombre de molécules qui forment la pointe de suivi complexe 27. Plus grands ensembles de protéines sont généralement beaucoup mieux la pointe des trackers. Par exemple, ces ensembles complexes que les kinétochores de levure isolées peuvent rester couplé à des microtubules extrémités pour heures 28. Certaines protéines de microtubules liaison, par exemple Ndc80 complexe protéique kinétochore, ont été trouvés dans l&#39;impossibilité de suivre avec microtubules se termine à un niveau de la molécule unique, encore Ndc80 est très efficace dans le couplage de la motion de perle cargaison 19,29-31. Ainsi, afin de comprendre le mécanisme de la pointe de poursuite par différents complexes protéiques, ainsi que leurs rôles biologiques, il est important d&#39;examiner la pointe de suivi en fonction du nombre de molécules dans le complexe de la pointe de poursuite, ainsi que pour déterminer la capacité de ces complexes à exposer la motilité collective sur la surface de chargement des billes. (figure 1A). Tout d&#39;abord, les lames de verre sont disponibles dans le commerce modifiés pour attacher court tube en polyéthylène (protocole 1). La chambre d&#39;écoulement de microscopie réutilisable est ensuite assemblée à partir d&#39;un tel coulisseau et le plasma nettoyé et traité au silane lamelle (protocole 2) 32 à 34 chimiquement ou. Le volume de la chambre résultant est seulement 20-25 pi (ou aussi petite que 15 pi, voir la note 3 dans le Protocole 1), y compris le volume de la tubulure d&#39;admission. Disponibles dans le commerce chambres d&#39;écoulement peuvent également être utilisés, mais leur volume est généralement plus grande, ce qui conduit à la perte inutile de protéines. Si une chambre plus grande est utilisé, le volume de toutes les solutions dans les protocoles ci-dessous doit être réduite proportionnellement. graines de microtubules sont ensuite préparées, par exemple en utilisant lentement hydrolysable du GTP analogique, GMPCPP (guanosine-5&#39;-[(α, β)-methyleno] triphosphate) (protocole 3, voir aussi Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Les graines sont immobilisés sur une lamelle couvre-objet et la surface nettoyée est ensuite bloquée pour empêcher l&#39;absorption non spécifique d&#39;autres protéines 32 (protocole 4 décrit l&#39;immobilisation de graines à l&#39;aide de la digoxigénine). Les microtubules segmentés peuvent être préparés en utilisant le protocole 5. La raison principale de cette approche est que les polymères de microtubules dynamiques, qui se forment dans la présence de GTP, peuvent être temporairement stabilisée par l&#39;ajout des «caps» de courtes segments de tubuline stables, qui contiennent GMPCPP. Ces capsules contiennent également de la tubuline marqué à la rhodamine, de sorte qu&#39;ils peuvent être éliminés simplement en illuminant le champ de vision avec un laser de 530 à 550 nm ou une lampe à arc au mercure (Protocole 6) 36. L&#39;intensité de fluorescence du signal de suivi de pointe peut alors être utilisée pour estimer le nombre de molécules qui se déplacent avec les extrémités de désassemblage des microtubules, en tenant compte de l&#39;irrégularité de l&#39;éclairement de champ de microscope (Protocole 7). Une approche similaire peut être utiliséepour étudier les interactions entre les microtubules de dépolymérisation et de perles de protéine revêtu, préparé comme décrit dans 27 (protocole n ° 8). Certaines protéines se lient facilement aux parois des microtubules segmentées, mais pinces laser peuvent également être utilisés pour la tenue du bourrelet à proximité de la paroi des microtubules, ce qui favorise sa fixation.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. Microscopie et autres équipements.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>D’autres modèles de microscopes capables d’imagerie DIC et d’épifluorescence peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Huile 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49</td></tr><tr><td>NA Chauffage d’objectif</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtre fluorescent</td><td>Chroma</td><td>49004 ou 49008 41017 ou 49020</td><td>optimisé pour la fluorescence de la Rhodamine&nbsp ; optimisé pour la fluorescence GFP</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition</td><td>freeware MicroManager Dispositifs moléculaires</td><td>non applicables MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ d’autres logiciels peuvent être utilisés pour acquérir des images et pour un suivi de particules</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Caméra EMCCD haute sensibilité</td></tr><tr><td>Piégeage laser</td><td>IPG Photonique</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>Laser 1 064 nm, 10 W</td></tr><tr><td>Lasers d’excitation de fluorescence</td><td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP</td><td>excitation des fluorophores verts excitation des fluorophores rouges</td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Chambres d’écoulement commerciales</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 ou RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Pompe de perfusion</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatus</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Les deux pompes fournissent le débit de liquide requis, mais une pompe péristaltique peut pulser à très basse vitesse. Le débit avec une pompe à seringue est plus constant pour une large gamme de débits, mais cette pompe a une inertie.</td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. Préparation de la chambre de microscopie.</td></tr><tr><td>Lames de microscope modifiées pour chambres réutilisables</td><td>Soufflage de verre de précision du Colorado</td><td>Commande sur mesure</td><td>www.precisionglassblowing.com Fentes soniques dans les lames à l’aide de schémas en Figure 1</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>D.I. 0,58 mm, D.E. 0,965 mm ; utilisez ces tubes pour connecter la chambre assemblée à la pompe et au conteneur à déchets</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>D.E. 0,28 mm, D.E. 0,61 mm ; utilisez ces tubes pour fabriquer la chambre réutilisable</td></tr><tr><td>Lames de microscope régulières</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>D’autres lames similaires peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>D’autres lamelles similaires peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Mastic silicone</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, MASTIC SILICONE CURE 5 MIN</td><td></td></tr><tr><td>Colle époxy</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif cyanoacrylate</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Ou adhésif cyanoacrylate d’autres fabricants</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 3. Nettoyage et revêtement des lamelles.</td></tr><tr><td>Molecular Tamis, Grade 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass Staining Jar</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip Ceramic Holder</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigénine AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 4. Préparation des graines et des microtubules segmentés.</td></tr><tr><td>Tubuline</td><td>purifiée à partir de cervelle de vache Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Pour les protocoles de purification, voir 49&ndash ; 51 Tubuline porcine non étiquetée Tubuline</td></tr><tr><td>marquée</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigénine)</td><td>Tubuline porcine marquée à la rhodamine La tubuline peut être marquée avec n’importe quel colorant réactif aux amines comme dans la référence 52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Aliquote et stocker à -70 &deg ; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vaseline, lanoline et paraffine à 1:1:2 par masse</td><td></td><td>voir référence9</td></tr></tbody></table>

préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions poussé par le démontage microtubules ends

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Dépolymérisation des microtubules peut fournir une force pour le transport de différents complexes de protéines et de perles revêtus de protéine in vitro. Les mécanismes sous-jacents sont supposés jouer un rôle essentiel dans les mouvements des chromosomes microtubules dépend cours de la division cellulaire, mais les protéines concernées et leurs rôles exacts sont mal définis. Ainsi, il ya un besoin croissant de développer des tests qui permettent d&#39;examiner cette motilité in vitro en utilisant des composants purifiés et milieu biochimique défini. Les microtubules, cependant, sont par nature instables des polymères; leur commutation entre la croissance et le raccourcissement est stochastique et difficile à contrôler. Les protocoles que nous décrivons ici profiter des microtubules segmentées qui sont faites avec le photoablatable stabilisation bouchons. La dépolymérisation des microtubules tels segmentées peut être déclenchée avec une résolution spatiale et temporelle élevée, aidant de ce fait les études de motilité au niveau des extrémités de désassemblage des microtubules. Cette technique peut être utilisée pour carry à une analyse quantitative du nombre de molécules dans les complexes de protéines marquées par fluorescence, qui se déplacent avec processively dynamique des microtubules se termine. Afin d&#39;optimiser un rapport signal sur bruit dans cet et d&#39;autres dosages quantitatifs fluorescentes, des lamelles doivent être traités pour réduire l&#39;absorption non spécifique de protéines solubles marqués par fluorescence. Des protocoles détaillés sont prévus pour prendre en compte les irrégularités de l&#39;illumination fluorescente, et déterminer l&#39;intensité d&#39;un fluorophore unique en utilisant l&#39;ajustement gaussien équidistants. Enfin, nous décrivons l&#39;utilisation des microtubules segmentés pour étudier les mouvements des microtubules dépendant des microbilles de revêtus de protéine, apportant des éclairages sur la capacité des différentes protéines motrices et non motrices à deux dépolymérisation des microtubules au mouvement de la cargaison processive.

Suivi de la dépolymérisation des microtubules protéines se termine. Levure kinetochore composant Dam1 est de loin le meilleur conseil-tracker de la dépolymérisation des microtubules se termine 14. Ce complexe de 10 sous-unité marquée par la GFP peut être facilement exprimée et purifiée à partir de cellules bactériennes 18,38, nous vous recommandons donc l&#39;utiliser comme un contrôle positif pour le dosage de la pointe de suivi. Une protéine fluorescente qui permet de suivre à la...

Les microtubules sont des polymères intrinsèquement instables, et leur commutation entre la croissance et de raccourcissement est stochastique et difficile à contrôler. Nous décrivons ici les protocoles à l&#39;aide de microtubules segmentés avec des bouchons de stabilisation photoablatable. Dépolymérisation des microtubules segmentées peut être déclenchée avec une résolution temporelle et spatiale, aidant ainsi l&#39;analyse de mouvements avec les extrémités des microtubules démontage.

Préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions Poussé par le démontage microtubules Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les mouvements des molécules de protéines et des billes enrobées de protéines avec les extrémités des microtubules en dépolymérisation. Ceci est réalisé en assemblant une chambre d’écoulement réutilisable avec une lamelle de couverture de taille propre. Ensuite, les graines de microtubules sont préparées attachées à la lamelle et utilisées pour nucléer les microtubules, qui sont ensuite stabilisés temporairement avec des capuchons photodestructibles.Ensuite, des protéines marquées à la GFP ou des billes enrobées de protéines sont introduites dans la chambre d’écoulement et se lient à des microtubules segmentés. La dépolymérisation de la micro-baignoire est ensuite déclenchée par le retrait des bouchons par photo-ablation. Les images sont analysées avec CH pour déterminer si les protéines marquées présentent un comportement de suivi des pointes, c’est-à-dire un mouvement avec les extrémités des microtubules en dépolymérisation.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déclencher la microtubule isation avec une résolution temporelle et spéciale élevée. La démonstration visuelle de cette méthode est essenti

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Cette vidéo décrit TIRF, une technique basée sur la microscopie à réflexion interne totale pour visualiser la dynamique de polymérisation de l’actine et des microtubules. La méthode permet l’imagerie à haute résolution de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules en temps réel, ce qui est essentiel pour comprendre les interactions cellulaires.

Microscopie TIRF pour visualiser la dynamique du couplage de l’actine et des microtubules

Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.

L&#39;imagerie à haute résolution et d&#39;analyse de l&#39;individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d'analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d'image MATLAB-basé.

Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.

Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris

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Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

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Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

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