Préparation des microtubules sectoriels pour étudier les motions Poussé par le démontage microtubules Ends

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les mouvements des molécules de protéines et des billes enrobées de protéines avec les extrémités des microtubules en dépolymérisation. Ceci est réalisé en assemblant une chambre d’écoulement réutilisable avec une lamelle de couverture de taille propre. Ensuite, les graines de microtubules sont préparées attachées à la lamelle et utilisées pour nucléer les microtubules, qui sont ensuite stabilisés temporairement avec des capuchons photodestructibles.

Ensuite, des protéines marquées à la GFP ou des billes enrobées de protéines sont introduites dans la chambre d’écoulement et se lient à des microtubules segmentés. La dépolymérisation de la micro-baignoire est ensuite déclenchée par le retrait des bouchons par photo-ablation. Les images sont analysées avec CH pour déterminer si les protéines marquées présentent un comportement de suivi des pointes, c’est-à-dire un mouvement avec les extrémités des microtubules en dépolymérisation.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déclencher la microtubule isation avec une résolution temporelle et spéciale élevée. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Le protocole commence par la préparation et l’assemblage de la chambre d’écoulement à l’aide d’un broyage par ultrasons.

Modifiez les lames de microscope normales pour qu’elles aient deux rainures. Faites les rainures à 14 millimètres de distance. À un millimètre près, ce qui est optimal pour les chambres assemblées à l’aide de lamelles carrées de 22 millimètres.

Ensuite, placez un tube en polyéthylène de 100 millimètres de long dans chaque rainure de la glissière, en laissant des surplombs d’environ cinq millimètres aux extrémités intérieures des rainures. Fixez les tubes à l’intérieur des rainures avec de la colle cyanoacrylate, en enfonçant complètement les tubes dans les rainures. Remplissez soigneusement les rainures avec de la colle époxy sans renverser.

Laissez-le sécher pendant une journée. Le lendemain. Utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper la colle solidifiée, à trois à quatre millimètres de l’extrémité distale de chaque site de fixation.

Retrait des pièces proximales au centre de la lame. Les tubes doivent rester dans leurs rainures et les coupes doivent former des surfaces planes avec des ouvertures de tube. Ensuite, remplissez une seringue d’eau et vérifiez si les tubes fonctionnent correctement.

Si le liquide s’écoule librement, mettez une goutte de colle époxy d’environ cinq millimètres de diamètre aux extrémités extérieures des rainures et laissez-la sécher pendant environ une journée. Les chambres d’écoulement terminées sont donc durables et peuvent être utilisées à plusieurs reprises pendant de nombreux mois. Ce protocole de trois heures prépare 12 bordereaux de protection.

Il nécessite une hotte, un porte-couvercle en céramique, trois bocaux de coloration de 15 millilitres et 1 bocal en verre de 250 millilitres avec couvercle. Les pots de coloration doivent contenir quatre lamelles de 22 millimètres numéro 1 régulier dans une pile. Commencez avec une pile de 12 lamelles pré-nettoyées et séchées dans le support en céramique.

Remplissez le bocal avec plus une solution de silène et abaissez lentement les lames. Fermez le bocal et incubez-le pendant cinq minutes à température ambiante. L’étape la plus critique pour assurer une civilisation uniforme des lamelles est d’éviter toute trace d’eau pendant l’incubation des lamelles dans la solution de sélénée.

Cette étape est essentielle pour une fixation serrée des graines de micro-tubaires. Plus tard dans un protocole, lorsque les lamelles sont prêtes, retirez le support en céramique du pot. Ensuite, transférez les lamelles individuellement à l’aide d’une pince à épiler recouverte de téflon du support en céramique vers des bocaux de coloration chargés de méthanol.

Chargez maintenant les trois bocaux dans le réservoir d’eau d’un bain sonique avec un piédestal en métal ou en verre. Le niveau d’eau doit être aux deux tiers de la hauteur des bocaux, sonicez les bocaux à 70 watts pendant 20 minutes. Pendant la sonication, changez la solution de méthanol toutes les cinq minutes.

Lorsque la sonication est terminée, rincez, le couvercle se nettoie 10 fois avec de l’eau déminéralisée. Si la siloisation a fonctionné correctement, les lamelles apparaîtront sèches Lorsqu’elles seront retirées de l’eau, quelle que soit leur apparence, éliminez soigneusement toute eau résiduelle. En utilisant le transfert d’azote gazeux, le couvercle séché glisse dans un récipient refermable séché à l’azote.

Interlay Kim essuie entre les cahiers des pochettes. Ils peuvent être conservés de cette façon pendant plusieurs semaines à température ambiante. Ce protocole nécessite une à deux heures, une chambre d’écoulement et des graines microtubiales préparées G-M-P-C-P-P stabilisées.

Tout d’abord, assemblez la chambre d’écoulement. Fixez deux morceaux de ruban adhésif double face le long de la zone centrale de cinq millimètres de large de la diapositive préparée et appuyez fermement sur la glissière de recouvrement sur le ruban. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, remplissez la chambre avec 100 microlitres de solution B rrb 80 à l’aide d’un tube.

Ensuite, pressez une petite goutte de mastic à coulée rapide bicolore sur une petite boîte de Pétri en plastique. Mélangez-le rapidement et soigneusement avec un cure-dent. Il deviendra vert.

Appliquez immédiatement le scellant sur tous les bords de la lamelle. Vérifiez si le mastic ne pénètre pas trop profondément sous la lamelle. Si un tube est bloqué, débranchez la seringue et soulevez le tube pour appliquer une légère pression afin d’empêcher le produit d’étanchéité de s’infiltrer Après 10 minutes, assurez-vous que le débit de la solution n’est pas limité.

Transférez ensuite la chambre sur une platine de microscope chauffée à 32 degrés Celsius. Fixez l’un des tubes à une pompe pour l’élimination de la solution. Plongez l’extrémité libre du tube d’entrée dans un flacon de 0,5 millimètre avec un tampon BRB 80 chaud.

Réglez la pompe à 100 microlitres par minute et, au besoin, utilisez-la pour expulser doucement les bulles d’air. Cela peut également être fait manuellement. Utilisez maintenant la pompe pour charger 30 microlitres d’anticorps antigéniques chauds.

Éteignez la pompe et attendez cinq minutes. Éteignez la pompe pendant toutes les incubations. Ensuite, lavez les chambres avec environ 100 microlitres de b rrb 80 chaud.

Ensuite, perfuser 50 microlitres de 1 % onic F1 27 dans BRB 80. Attendez 10 minutes qu’il bloque la surface hydrophobe de la lamelle siloisée. Lavez maintenant les chambres avec 100 microlitres de tampon de motilité.

Ensuite, réduisez la vitesse de la pompe à 15 microlitres par minute et perfuser la chambre avec 30 à 40 microlitres de graines de microtubules diluées de un à 200 à un à 600 dans un tampon de motilité. Incuber les graines pendant 15 minutes, puis laver la chambre avec 400 microlitres de tampon de motilité à 100 microlitres par minute pour éliminer toute matière non liée. Ensuite, réduisez la vitesse de la pompe à 30 microlitres par minute et perfuser la chambre avec une solution de tubuline préchauffée non étiquetée.

Les aspects les plus critiques de ce protocole sont d’éviter les bulles d’air. Utiliser des solutions de tubuline fraîchement préparées et suivre le calendrier exact du protocole, en particulier pendant le recouvrement microtubulaire. Surveillez la croissance des micro-tubiums à l’aide d’optiques DIC pendant l’incubation de cinq à sept minutes.

Les microtubules grandissent généralement d’environ 10 microns, échangent rapidement la solution avec le mélange de tubuline Rumine d’avant-guerre et permettent huit à 10 minutes de temps d’incubation supplémentaire. Lavez bien la chambre avec 100 microlitres de tampon de motilité à 20 microlitres par minute pour éliminer les turbulences et les nucléotides, ainsi que les fragments de micro-tubules solubles. Ensuite, perfuser la chambre avec une solution réchauffée de protéines marquées à la GFP ou de billes enrobées de protéines et procéder à l’imagerie du composant cinétique de levure DAM marqué à la GFP a été purifié à partir de cellules bactériennes et utilisé comme contrôle positif pour les tests de suivi de pointe.

Ces protéines suivent l’extrémité dépolymérisante d’un micro-tubule et se déplacent régulièrement vers la graine attachée à la lamelle. Ces protéines apparaissent sous la forme d’une ligne oblique sur un graphique correspondant, qui peut ensuite être analysé pour déterminer le nombre de molécules de protéines dans le complexe de suivi de pointe. Cette analyse est détaillée dans le protocole texte.

En revanche, les protéines qui ne parviennent pas à basculer la piste ne montrent pas d’enrichissement du signal de fluorescence à l’extrémité micro de désassemblage. C’est le cas de la protéine humaine NDC 80 GFP. La liaison entre les billes recouvertes de protéines et les microtubules est généralement assez forte, de sorte que lorsque des billes étaient ajoutées à la chambre de microscopie, elles se liaient facilement aux microtubules segmentés attachés à la lamelle.

Lorsque le suivi des billes est processif, de nombreuses observations peuvent être faites. Les billes qui se sont attachées à un microtubule ont montré un mouvement en forme d’arc lorsque les microtubules pivotent légèrement autour du site de leur croissance. Lorsque le chapeau stabilisateur est allumé, si un seul segment rouge est visible distal de la graine et de la perle, la perle est attachée à un micro-tubule.

Le capuchon peut souvent être vu suivant le mouvement des perles jusqu’à ce que le chapeau soit blanchi Le mouvement des perles peu de temps après le blanchiment semble cohérent avec l’orientation des microtubules. Au fur et à mesure que le micro-tubial se raccourcit et que la bille se déplace vers la graine, l’amplitude des oscillations en forme d’arc diminue. Si les billes ne parviennent pas à former des attaches durables aux microtubules stables.

Le piégeage laser peut être utilisé des billes avec différentes constructions protéiques de kinésine dirigée plus extrémité SE E a besoin de cette technique pour lancer les billes sur les parois microtubulaires segmentées en présence d’un TP. Ces billes se déplaçaient rapidement vers les extrémités plus des micro-tubiums coiffés sur un graphique. Ce mouvement a entraîné une ligne oblique dirigée vers le chapeau après la destruction du capuchon. Les billes recouvertes de protéine espion tronquée se sont détachées du micro-tubule comme indiqué par la flèche verte.

En revanche, les billes avec une protéine B pleine longueur pourraient maintenir le mouvement dans la direction inverse. Ceci est vu comme un motif en zigzag sur le graphique chm en raison d’un mouvement dans des directions opposées à l’extrémité positive ou négative des microtubules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des chambres d’écoulement et de cultiver des microtubules segmentés pour étudier les mouvements entraînés par le désassemblage des micro-tubaires.