Reconstitution et caractérisation de composites actine-microtubule avec dynamique et mécanique induites par moteur accordable

Notre travail rapproche les efforts de reconstitution du cytosquelette d’un pas important vers l’imitation des conditions cellulaires en concevant des composites d’actine et de microtubules, entraînés par des moteurs kinésine et myosine pour ajuster, restructurer et déplacer activement. La dynamique et la structure de nos composites peuvent être programmées avec précision en ajoutant, enlevant et réglant indépendamment les différents composants pour présenter une riche base de phase de contraction, d’infection, de désembuage, de grossissement et de rupture. Notre approche est largement applicable à la conception, à la création et à la caractérisation de plateformes de matière active qui intègrent plusieurs composants générateurs de force qui agissent sur différents substrats dans un seul système.

Daisy Achiriloaie et Maya Hendija feront la démonstration de la procédure. Chercheurs de premier cycle de notre laboratoire. Pour commencer, ajoutez les réactifs à un tube microcentrifuge noir stérile de 1,5 millilitre à l’aide d’une micropipette et d’embouts de pipettes stériles pour former des grappes de moteurs kinésines qui se lient et exercent des forces entre les paires de microtubules.

Mélanger doucement en pipetant la solution de haut en bas. Ensuite, incuber la solution pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, la protéger de la lumière. Pour préparer un réseau composite co-enchevêtré de filaments d’acton et de microtubules, réglez le bloc thermique à 37 degrés Celsius.

Ajouter les réactifs dans un tube microcentrifuge stérile de 0,6 millilitre. Assurez-vous que le volume total est de 25 microlitres. Pipeter doucement la solution de haut en bas pour la mélanger et la placer sur le bloc de chaleur à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant une heure.

Après cela, retirez le tube du bloc de chaleur et utilisez une micro-pipette pour mélanger doucement 0,84 microlitre de phalloïdine 100 micromolaires. Incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Pour préparer les composites actifs pour l’imagerie focale conf, ajouter les réactifs à la solution et mélanger doucement en pipetant de haut en bas.

Diviser la solution en trois aliquotes de 10 microlitres et les étiqueter comme K, K plus M et témoin négatif. Ajouter 2,54 microlitres de myosine à l’aliquote K plus M et 2,54 microlitres de PEM à K et aliquotes témoins négatives. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres de grappes de kinésine aux aliquotes K et K plus M et pipette de haut en bas pour mélanger.

Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres de PEM au contrôle négatif en utilisant la même technique. Utilisez une micropipette pour faire circuler lentement chaque solution dans le canal correspondant des chambres d’échantillonnage par capillarité. Poussez très lentement et doucement sur la pipette pour ne pas introduire de bulles d’air dans le canal.

Scellez les deux extrémités ouvertes de chaque canal avec de la colle époxy ou UV à séchage rapide. Lorsque l’adhésif est complètement sec, placez le canal sur le microscope pour imager le composite aussi près que possible de l’état inactif initial. Image du canal K et des canaux K plus M en premier, suivis du canal de contrôle.

Notez le temps écoulé entre l’ajout des grappes de kinésines aux aliquotes K et K plus M et le début de l’acquisition des données. Pour préparer l’actine à l’actine ou aux agents de réticulation AA, ajoutez Biotine-Actine, NeutrAvidine, Biotine et PEM dans un tube de microcentrifugation et mélangez-les doucement en les pipetant de haut en bas. De même, pour les microtubules aux microtubules ou aux réticulateurs MM, ajoutez Biotine-tubuline, NeutrAvidin, Biotine et PEM à un tube microcentrifuge et mélangez-les doucement en les pipetant de haut en bas.

Enveloppez le tube dans un film de plafond thermoplastique pour créer un joint étanche et placez-les dans un radeau de flottaison dans un bain sonique à température contrôlée, réglé à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Pour incorporer des complexes de réticulation A-A dans des échantillons pour l’imagerie, ajoutez les réactifs à un tube microcentrifugé. Assurez-vous que le volume total est de 25 microlitres.

De même, pour les complexes de réticulation M-M, ajouter les réactifs montrés à l’écran dans un tube de microcentrifugation. Mélangez la solution en la pipetant de haut en bas et placez-la sur le bloc de chaleur à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant une heure. Après cela, retirez le tube du bloc de chaleur et utilisez une micro-pipette pour mélanger 0,84 microlitre de phalloïdine 100 micromolaires.

Incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière et répéter la procédure indiquée précédemment pour préparer les composites actifs pour l’imagerie confocale. Les monofibres d’actine et les dimères de tubuline sont copolymérisés pour former des réseaux co-enchevêtrés de filaments d’actine et de microtubules. La myosine deux mini-filaments et les grappes de kinésine poussent et tirent sur les filaments pour chasser les composites de l’état d’équilibre.

La réticulation passive est réalisée en utilisant NeutrAvidin pour lier un filament d’actine biotinylé ou des microtubules. Les deux mini-filaments de myosine, les grappes de kinésine ou les deux moteurs sont incorporés dans des composites sans réticulations passives, des réticulations actine-actine et des réticulations microtubule-microtubule. L’imagerie confocale bicolore de composites de cytosquelette pilotés par la myosine avec des concentrations de myosine et des fractions molaires d’actine variables est présentée ici.

La vélocimétrie par image de particules montre que l’activité de la myosine d’actine déclenche une dynamique contractile coordonnée de l’actine et des microtubules dans des composites co-intriqués. Ici, différentes couleurs de flèche correspondent à différentes vitesses comme indiqué dans l’échelle de couleurs à droite des champs vectoriels. La microscopie dynamique différentielle résolue dans le temps est effectuée sur les canaux des microtubules et de l’actine de séries chronologiques afin de déterminer les caractéristiques des temps de désintégration par rapport au nombre d’ondes pour l’actine et les microtubules.

Les vitesses de contraction sont déterminées au moyen de courbes de temps d’ajustement à la décroissance, moyennées sur tous les temps de latence pour toute la durée de chaque série chronologique de 45 minutes. La microscopie dynamique différentielle résolue dans le temps quantifie la variation de la dynamique au fil du temps en évaluant les temps de désintégration pour des intervalles consécutifs de six minutes pendant le temps d’activation de 45 minutes pour l’actine et les microtubules. Les vitesses de contraction résolues dans le temps pour les filaments d’actine et les microtubules sont déterminées à partir des ajustements aux courbes de temps de désintégration correspondantes.

L’analyse d’autocorrélation d’images spatiales quantifie la restructuration motrice des composants actifs du cytosquelette en comparant les courbes d’autocorrélation pour les différents réseaux au début de l’expérience par rapport à la fin. Les longueurs de corrélation résolues dans le temps déterminées par des ajustements exponentiels des courbes de corrélation automatique montrent des composites qui ne se restructurent pas par rapport à ceux qui se restructurent substantiellement. Deux images confocales couleur de composites de microtubules d’actine pilotés par Kinesine montrent une restructuration dépendante de la formulation au fil du temps sans agents de réticulation Les composites se restructurent en amas riches en microtubules faiblement connectés.

La réticulation actine-actine favorise la colocalisation des microtubules d’actine, tandis que la réticulation microtubule-microtubule améliore le mélange D. La microscopie dynamique différentielle et l’analyse d’autocorrélation d’images spatiales montrent l’effet de la réticulation et de la concurrence des moteurs de mycine et de kinésine sur la dynamique et la structure variables dans le temps des composites. Pour imiter plus étroitement les conditions cellulaires, les chercheurs peuvent incorporer des filaments intermédiaires, d’autres moteurs et des protéines de liaison qui contrôlent la longueur et la rigidité des filaments.

Des mesures de métrologie de pinces optiques peuvent également être effectuées pour caractériser la mécanique des composites. En utilisant notre approche, les chercheurs peuvent ajuster avec précision la dynamique et la structure de la matière active composite inspirée du cytosquelette dans un espace de phase sans précédent pour émuler divers processus cellulaires et concevoir des matériaux programmables reconfigurables.