Caractérisation de la protéine transmembranaire d’une vésicule extracellulaire unique par cytométrie nano-flux

La dernière génération d’outils de caractérisation des véhicules électriques est capable d’analyser simultanément plusieurs paramètres uniques. La cytométrie en nanoflux mesure toutes les particules biologiques de plus de 45 nm sans marquage et identifie les caractéristiques spécifiques des sous-populations par diverses techniques de marquage fluorescent.

La caractérisation approfondie des véhicules électriques peut être difficile, nécessitant plusieurs instruments pour décrire des paramètres individuels. La mesure de ces critères clés dans une seule technique comme la cytométrie en nanoflux décrit plusieurs sous-populations de VE simultanément. Ainsi, chaque VE est mesuré individuellement en identifiant les particules de plus de 14 nanomètres de diamètre sans marquage avant de déterminer leur fluorescence.

Cela permet d’obtenir un ensemble de données robuste en supprimant les faux positifs. La nanocytométrie en flux peut être appliquée aux VE provenant de diverses sources, y compris celles enrichies à partir de plasma, de LCR et de milieu de culture. Cette technique est également utilisée pour l’analyse des virus, des nanoparticules lipidiques et des nanomatériaux.

Il est important d’optimiser le protocole d’étiquetage. Cela maximise toute fluorescence associée à une particule par rapport à toute fluorescence résiduelle laissée dans le tampon. Pour commencer, allumez l’instrument, chargez Nano-Flow Profession et sélectionnez Start Up dans le menu déroulant Sheath Flow, chargez l’eau dans le quai de chargement et sélectionnez Boosting dans le menu déroulant Sheath Flow.

Diluez les billes de QC une à 100 dans de l’eau distillée dans un tube de 0,6 microlitre et placez-les dans le quai de chargement pour introduire l’échantillon dans le système. Ensuite, boostez l’échantillon pendant 45 secondes comme démontré précédemment pour remplacer complètement l’échantillon précédent, l’eau ou la solution de nettoyage. Lors de l’amplification, réglez la puissance laser sur le modèle prédéfini pour les perles QC à 250 nanomètres FL QC standard.

Plus tard, pour réduire la pression du système, sélectionnez la pression d’échantillonnage dans le même menu déroulant et réglez la pression d’échantillonnage automatique sur un kilo pascal pour maintenir une pression constante. Lancez ensuite l’analyse d’une minute en sélectionnant Time To Record dans les contrôles d’acquisition. Les données seront tracées sur le diagramme à points montrant une échelle logarithmique pour l’intensité de la diffusion latérale et une intensité de fluorescence sélectionnée.

Avant d’enregistrer le fichier, insérez le nom du fichier et la dilution de l’échantillon. Ensuite, sélectionnez décharger pour retirer le tube du quai de chargement. Remplacez les billes QC par 150 microlitres de solution de nettoyage et nettoyez pendant plus de 30 secondes en sélectionnant Boosting.

À l’aide d’un tube contenant 150 microlitres d’eau, retirez tout excès de solution de nettoyage de l’extrémité capillaire en trempant l’embout dans de l’eau. Ensuite, diluez les billes standard de taille une à 100 dans de l’eau et chargez 100 microlitres dans le quai de chargement. Maintenant, réglez la puissance laser sur le modèle prédéfini, S16 EXO 68 à 155 nanomètres.

Ce paramètre s’applique à la fois à la norme de taille et aux échantillons contenant des véhicules électriques de moins de 200 nanomètres. Sélectionnez l’échantillonnage et procédez à l’enregistrement de l’échantillon pendant une minute. Effectuez la troisième mesure avec un échantillon d’eau ou de PBS pour créer un dévalorisant de mesure blanc, identifiant les faux positifs à éliminer par le logiciel.

Diluer les échantillons de VE non marqués dans du PBS à une plage de concentration de particules appropriée d’une fois 10 à la huitième à cinq fois 10 à la huitième particules par millilitre pour l’analyse nFCM. Et chargez 10 à 100 microlitres de l’échantillon dilué dans le quai de chargement. Si la concentration de particules est inconnue, commencer par une dilution de un à 100 de l’échantillon EV.

La concentration de l’échantillon peut être rapidement estimée par la taille du point laser sur la caméra CCD pendant le boost, ou par l’observation de la trace de sursaut de l’événement pendant l’échantillonnage. Une fois que l’échantillon chargé est boosté pendant 45 secondes, enregistrez pendant une minute et enregistrez le fichier comme indiqué précédemment. Après l’enregistrement, commencez à analyser ces données, en passant de l’onglet Acquisition à l’onglet Analyse et en ouvrant les fichiers NFA enregistrés.

Pour une mesure précise de l’échantillon, utilisez les deux mesures standard prises avant la mesure d’échantillonnage pour définir les valeurs pour la comparaison de l’échantillon ainsi que le blanc. Créez la courbe standard de taille pour la conversion de la dispersion latérale en diamètre en sélectionnant le fichier standard de taille et en utilisant l’outil de définition du seuil. Le seuil, visible dans la trace de rafale d’événement, identifie l’intensité minimale du signal requise pour qu’un événement soit considéré comme significatif.

Une fois le seuil défini, vérifiez les paramètres de graphique à points, SS-H ou SS-A sur l’axe X et FITC-A sur l’axe Y. Ouvrez l’outil Standard Curve Generation (Génération de courbe standard) et sélectionnez S16 EXO 68 à 155 nanomètres comme modèle de dimensionnement. Cliquez sur Trouver les pics pour identifier les intensités de diffusion latérale des pics comme des particules de 68, 91, 113 ou 155 nanomètres de diamètre.

Avant de fermer la fenêtre, vérifiez si la courbe du côté dispersé au diamètre a été générée avec une valeur R proche de un. Établissez la norme de concentration. Sélectionnez le fichier enregistré, cliquez sur la norme de comptage et entrez la concentration de particules de l’étalon.

Définissez les informations standard. Sélectionnez l’exemple de fichier EV et définissez le seuil. Sélectionnez le fichier vierge et cliquez sur Définir blanc pour identifier le nombre de faux positifs à supprimer du nombre d’échantillons.

Une fois l’outil de génération PDF ouvert, vérifiez le calibrage, la concentration et les dilutions de l’échantillon. Montrez ensuite la concentration de l’échantillon et la distribution granulométrique des particules. Après avoir étiqueté les échantillons EV comme décrit dans le manuscrit, prenez un microlitre de l’échantillon étiqueté et diluez-en un à 50 dans du PBS dans un tube de 0,6 millilitre.

Chargez l’échantillon dans le quai de chargement et appliquez une pression de suralimentation pendant 45 secondes. Assurez-vous également que les réglages laser sont corrects et que les lentilles appropriées sont chargées. Maintenant, passez à la pression d’échantillonnage et sélectionnez le temps d’enregistrement.

Après l’acquisition d’une minute, nommez le fichier de données et enregistrez. Déchargez l’échantillon, remplacez-le par une solution de nettoyage et boostez la solution de nettoyage pendant plus de 30 secondes avant de charger l’échantillon étiqueté suivant comme démontré précédemment. Pour la génération de PDF, appliquez les mêmes normes que celles démontrées précédemment.

Seule la mesure de l’blanc sera réglée différemment. Sélectionnez l’exemple de fichier et définissez le seuil. Sélectionnez l’outil de contrôle et utilisez le clic gauche pour tracer une ligne séparant la population positive de fluorescence.

Définissez les noms et les couleurs de la représentation. Définissez le fichier vierge et cliquez sur Définir blanc pour identifier le nombre de faux positifs à supprimer de chaque population différente. Ouvrez l’outil de génération PDF et identifiez la distribution de taille, la concentration et le pourcentage de la sous-population à fluorescence positive.

Sur le diagramme à points, modifiez l’axe Y pour afficher les mesures de fluorescence à partir du canal vert ou rouge. Définissez le blanc et générez le PDF comme indiqué précédemment. Sur le graphique à points, définissez l’axe X sur FITC et l’axe Y sur APC.

Utilisez l’outil de quadrant pour identifier les populations positives à double fluorescent. Définissez les noms et les couleurs pour qu’ils soient représentatifs, puis ouvrez le fichier PDF et sélectionnez les sous-populations fluorescentes. Les VE dérivés du C2C12 présentaient environ 50 % de CD9, 30 % de CD63 et 70 % de la population présentaient au moins un des trois marqueurs de VE.

Les profils de taille pour les sous-populations de VE marquées à la tétraspanine ont montré une taille médiane plus grande d’environ 75 à 85 nanomètres et moins de moins de 65 nanomètres EV par rapport à la population totale de particules. Les VE dérivés du SW620 ont montré une présentation d’environ 40 % de CD9, 7 % de CD63 et 42 % de particules comme ayant au moins un des trois marqueurs. Les VE dérivés du SW620 marqués à la tétraspanine ont montré une distribution plus normale et un diamètre médian plus grand entre 90 et 110 nanomètres avec des distributions similaires entre les sous-populations individuelles positives à la tétraspanine.

Le marquage membranaire a montré à plusieurs reprises une positivité de 80% des VE dérivés du C2C12 et du SW620. L’intensité de la diffusion latérale était corrélée à l’intensité FITC sur les diagrammes de points de C2C12 et SW620. Les pourcentages de double positif sont très similaires aux pourcentages positifs de tétraspanine.

Et le marquage CD63 semble montrer la corrélation la plus faible avec le marquage membranaire. Les mesures de positivité en pourcentage étaient similaires entre le marquage des anticorps avec et sans marquage membranaire supplémentaire. L’intensité moyenne de fluorescence pour les populations fluorescentes de VE dérivés de C2C12 suggère une présentation plus faible de CD63 et CD81 par rapport aux VE CD9, tandis que SW620 a montré que l’utilisation des trois anticorps fournit un signal de fluorescence plus important que n’importe quel marqueur d’anticorps individuel. Dans ce protocole, les marqueurs EV courants ont été marqués par fluorescence, mais de nombreuses cibles d’anticorps peuvent être choisies pour montrer l’origine de l’EV, la fonction EV, ou l’état de la maladie.