Haut différenciation de l'efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est de générer des cultures de cardiomyocytes de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes et de caractériser de manière appropriée le produit final à l’aide de la cytométrie en flux. Pour ce faire, des cultures monocouches de haute qualité de cellules souches pluripotentes indifférenciées sont générées. La cardiomyogenèse est ensuite induite en modulant la trajectoire du vent à l’aide de petites molécules.

Ensuite, les cardiomyocytes sont fixés, imprégnés et colorés à l’aide de conditions spécifiquement optimisées pour chaque anticorps. Enfin, les cellules sont analysées par cytométrie en flux. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des cultures très positives pour les marqueurs cardiaques, TNNI trois et IRX quatre, et qui démontrent des potentiels d’action semblables à ceux des ventricules.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celles des corps d’employés et de tresses, est qu’elle est relativement simple à mettre en œuvre et rentable. De plus, la technique génère des cultures de cellules qui sont très positives par troponine cardiaque I. Sans la variation et l’efficacité sous-jacentes internes observées par d’autres protocoles, la démonstration visuelle de la méthode est essentielle car la qualité des cellules de pré-différenciation affectera considérablement l’efficacité de la différenciation. De plus, une fixation incorrecte et perméable avant la coloration des anticorps entraînera des résultats de cytométrie en flux sous-optimaux, démontrant que la procédure sera démontrée par Shabo Bachar, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

L’aspect le plus difficile de la procédure suivante est de maintenir des cellules souches pluripotentes indifférenciées de haute qualité avant la différenciation. L’utilisation de cellules avec des caractéristiques de croissance sous-optimales affectera considérablement l’efficacité de la différenciation. Commencez cette procédure avec des HPC bien établis cultivés dans six boîtes à revêtement matriciel bien qualifiées HESC.

Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles présentent une morphologie homogène. Si les cellules présentent une morphologie épithéliale neurale ou fibroblastique comme indiqué ici, elles ne doivent pas être utilisées. Assurez-vous que les cellules prolifèrent de manière robuste lorsqu’elles sont assises à 0,75 million par passage de puits environ tous les trois jours à 75 % de passage de confluence les cellules avec dissociation au niveau de la cellule unique au moins cinq fois avant le début de la différenciation au passage.

Les cellules aspirent d’abord le milieu de croissance E huit et lavent les cellules deux fois avec quatre millilitres de PBS préchauffé à température ambiante. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de détachement cellulaire à température ambiante dans chaque puits et laissez le puits intact jusqu’à ce que les limites cellulaires commencent à s’arrondir. Cela prend généralement de trois à sept minutes et peut être observé macroscopiquement et confirmé à l’aide d’un microscope.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre bouché de coton avec une ampoule, les cellules ont été délogées et transférées dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de milieu DM EMF 12. Cela inactivera la solution de détachement cellulaire. Prélever une aliquote de 10 microlitres de la solution cellulaire et la mélanger avec 10 microlitres de bleu trian dans un tube de micro-centrifugeuse.

Comptez les cellules, puis centrifugez-les, le tube conique de 15 millilitres à 130 GS pendant cinq minutes. À température ambiante pendant la centrifugation, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre automatisé. Attendez-vous à une viabilité de 70 à 80 % à l’avenir.

Basez tous les numéros de cellules sur le nombre total de cellules par opposition au nombre de cellules viables. Après le spin, aspirez le milieu et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans D-M-E-M-F 12 à une concentration finale de 0,75 fois 10 aux six cellules par 500 microlitres, ajoutez 0,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à six puits dans laquelle chaque puits contient deux millilitres de milieu E huit. Avec un inhibiteur de roche, balancez doucement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour disperser uniformément les cellules dans le puits.

Remettez les cellules dans l’incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. 24 heures après l’emballage. Commencez à remplacer le milieu quotidiennement en utilisant deux millilitres par puits de E huit par sans inhibiteur de roche.

Optimiser la densité de semis pour atteindre une confluence de 100 % avant le début de la différenciation. Au jour zéro, les cellules sont confluentes à 100 % avec une morphologie compacte et un minimum de débris cellulaires. Commencez le processus de différenciation en remplaçant le milieu E eight par deux millilitres de différenciation. Douleur moyenne.

Tout d’abord, ajoutez 1,2 microlitre de CHIR à chacun. Eh bien, les premier et deuxième jours, il est courant d’observer une mort cellulaire significative de 40 à 50 %. Cependant, les cellules attachées conserveront une morphologie compacte.

Pendant ce temps, le milieu devient orange et trouble. Si un milieu rose, qui indique une mort cellulaire excessive, est observé, confirmez la viabilité cellulaire avec triam blue et arrêtez si la mort cellulaire dépasse 70 %. Sinon, le premier jour, répétez le processus de remplacement du milieu par deux millilitres de différenciation fraîche. Douleur moyenne. Tout d’abord, ajoutez 1,2 microlitre de CHIR dans chaque puits et les deuxième et troisième jours, remplacez-le par un milieu de différenciation frais.

Premièrement, au cours des jours trois à quatre, les cellules se rétabliront et la densité augmentera le quatrième jour. Remplacez le milieu dans chaque puits par une différenciation fraîche. Medium numéro un et un microlitre d’IWR one.

Du cinquième au sixième jour, la mort cellulaire est minime et des plaques denses peuvent commencer à apparaître le cinquième jour, remplacer le milieu par une différenciation fraîche. Le moyen numéro un, et ajoutez un microlitre d’IWR un à chaque puits du sixième au septième jour, remplacez le milieu par une différenciation fraîche. Moyen numéro un.

Du septième au huitième jour, une monocouche confluente est obtenue avec une morphologie compacte entrecoupée de plaques denses. Au huitième jour, les cellules commenceront à se contracter spontanément et les premières contractions seront souvent visibles dans les plaques denses. Le huitième jour, remplacez le milieu par une différenciation fraîche. Douleur moyenne.

Deuxièmement, continuez à remplacer par le milieu de différenciation numéro deux, tous les deux jours pendant toute la durée de la culture. Au 10e jour, une contraction plus robuste est observée et continuera à se propager dans toute la culture au cours des jours suivants. Cette vidéo montre les cellules au jour 30 et ici les cellules sont montrées au jour 55.

Pour prélever des cellules pour la cytométrie en flux, effectuez la collecte et le comptage de la dissociation cellulaire comme effectué précédemment. Notez que les cellules n’ont pas besoin d’être maintenues stériles à ce stade. Tout en faisant doucement tourbillonner la pastille cellulaire, ajoutez 100 microlitres de solution de fixation à la pastille cellulaire goutte à goutte.

Ensuite, incubez le tube sur de la glace pendant 15 minutes. Ajouter trois millilitres de solution de lavage de cellules, collecter les cellules par centrifugation après l’essorage, aspirer la solution tout en vortexant. Ajoutez 100 microlitres de solution perméable à la pastille de cellule goutte à goutte comme précédemment.

Ensuite, incubez le tube sur de la glace pendant 30 minutes. Ajouter trois millilitres de solution de lavage cellulaire. Recueillir les cellules par centrifugation et aspirer la solution.

Répétez l’opération pour un total de deux lavages après la perméation. Effectuer la coloration des anticorps comme décrit dans le document d’accompagnement à l’aide d’une pipette P 1000 à 400 microlitres de solution d’entretien cellulaire sur les cellules et les désagréger en les pipetant de haut en bas. Ensuite, pré-mouillez un capuchon de crépine de cellule sur un tube à fond rond avec 50 microlitres de solution de maintenance de cellule.

Placez le tube sur de la glace. Le capuchon de la crépine cellulaire empêche les agrégats cellulaires d’obstruer le cytomètre en flux. Ensuite, transférez la solution cellulaire dans le capuchon de la crépine de cellule et laissez la suspension cellulaire s’écouler par gravité.

Tapotez doucement le bas du tube sur le dessus de la paillasse afin que les cellules soient rassemblées dans un tube. Remettez le tube sur la glace le plus rapidement possible. Rincez la passoire avec 250 microlitres de solution d’entretien des cellules pour assurer une récupération maximale des cellules.

Maintenir les cellules sur glace et les protéger de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient analysées par cytométrie en flux pour déterminer la qualité des cardiomyocytes générés. À l’aide de ce protocole, les cellules ont été différenciées pendant 10 jours et colorées avec des anticorps contre le TNNI trois a, le marqueur cardiomyocytaire pan, le marqueur du muscle strié TNNT deux a et le marqueur cardiomyocytaire ventriculaire IRX quatre A. Notez que les conditions de fixation et de perméabilité ont été optimisées pour chaque anticorps afin d’atteindre le pourcentage maximum de cellules positives.

Les histogrammes montrent que 99 % des cellules contrôlées étaient positives pour TNNI trois et 96 % étaient positives pour IRX quatre. De plus, les cellules étaient très positives pour d’autres marqueurs de différenciation cardiaque, notamment TNNT deux, MLC deux V et MLC deux. A noter que l’affirmation concernant la pureté des cardiomyocytes et l’identité cellulaire est basée sur TNNI trois et IRX quatre.

La coloration MC deux V et MC deux A ne sont pas restreintes à la chambre pendant le développement et le TNNT deux se trouve également dans le muscle squelettique. Le potentiel d’action montré ici a été enregistré à partir d’un seul cardiomyocyte se contractant spontanément au jour 46 de différenciation en utilisant le clampage par patch de cellules entières. Le profil de potentiel d’action indique que des cardiomyocytes de type ventriculaire ont été obtenus.

Un faible pourcentage de profils nodaux a également été observé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cultures de cardiomyocytes de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes et de les caractériser par cytométrie en flux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison des défis courants rencontrés pour maintenir les cellules souches en tant que monocouches de haute qualité avant le début de la différenciation.

N’oubliez pas que travailler avec un fixateur peut être dangereux et personnel. Un équipement de protection tel qu’une blouse de laboratoire ou des gants doit toujours être porté lors de cette procédure.