Isolement et caractérisation des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris micro-disséqués

Ce protocole peut être utile pour répondre aux questions sur le rôle des plexus choroïdes et des cellules immunitaires périphériques dans la régulation du cerveau dans divers contextes dans des modèles murins. Ce protocole permet une analyse quantitative et qualitative approfondie des populations uniques de cellules immunitaires dans les plexus choroïdes de souris. La dissection des plexus choroïdes peut être difficile au début en raison de leur petite taille et de leur couleur transparente.

Nous vous recommandons de pratiquer d’abord sur des animaux non perfusés. Pour commencer, positionnez le cerveau disséqué à partir d’un C57 noir six souris dorsal vers le haut dans une boîte de Pétri et placez le plat sous les objectifs des boucles binoculaires. Tout en maintenant le cerveau en place à l’aide d’une pince, insérez les deux extrémités d’une autre paire de pinces vers le bas à travers la ligne médiane entre les hémisphères.

À l’aide de la pince, éloignez le cortex avec le callosité et l’hippocampe du septum, exposant le ventricule latéral et une partie du troisième ventricule. Identifiez le plexus choroïde latéral comme un long voile tapissant le ventricule latéral et s’évasant aux deux extrémités. Ensuite, à l’aide de deux extrémités de pinces minces, collectez le plexus choroïde latéral.

Veillez à ramasser la partie postérieure triangulaire cachée par le pli postérieur de l’hippocampe. Ensuite, éloignez le cortex avec le corps calleux et l’hippocampe de l’hémisphère controlatéral pour exposer tout le troisième ventricule et le ventricule latéral opposé. À l’aide de pinces fines, collectez le troisième plexus choroïde identifié comme une structure courte avec un aspect de surface granuleux.

Ensuite, collectez l’autre plexus choroïde latéral. Ensuite, insérez les deux extrémités de la pince entre le cervelet et le mésencéphale et détachez le cervelet des pons et de la médulla pour exposer le quatrième ventricule. Ensuite, identifiez le quatrième plexus choroïde comme une longue structure globulaire avec un aspect de surface granuleuse qui tapisse le quatrième ventricule de l’extrémité droite latérale à l’extrémité gauche entre le cervelet et la moelle épinière.

À l’aide de pinces fines, ramassez le quatrième plexus choroïde. Après avoir incubé tous les plexus choroïdes collectés avec de la collagénase IV, pipettez doucement de haut en bas environ 10 fois pour finaliser la dissociation. Remplissez ensuite le tube à 1,5 millilitre avec un tampon MACS pour arrêter l’activité de la collagénase IV.

Ensuite, centrifugez les cellules et jetez le surnageant avant de laver les cellules avec 1,5 millilitre de tampon MACS. Après avoir ajouté les billes de compensation et les solutions d’anticorps appropriées, incuber les échantillons sur de la glace pendant 30 à 45 minutes, en les protégeant de l’exposition à la lumière. Remplissez ensuite les tubes avec 1,5 millilitre de tampon MACS et centrifugez les cellules et les billes de compensation.

Après avoir réutilisé les cellules et les billes de compensation dans 500 microlitres de tampon MACS, filtrez les cellules à travers une passoire de 70 microns. Après avoir allumé le cytomètre en flux et le logiciel, sélectionnez la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale et à la porte pour les cellules en fonction de leur taille. Créez ensuite une porte fille pour les cellules simples avec une zone de diffusion vers l’avant par rapport à une hauteur de dispersion vers l’avant.

Ensuite, créez une porte fille pour les cellules vivantes avec DAPI par rapport à la zone de diffusion directe pour exclure les cellules positives DAPI. Ensuite, créez une porte fille pour les cellules immunitaires CD45 positives avec CD45 par rapport à la zone de diffusion vers l’avant. Maintenant, créez une porte fille à partir des cellules CD45 positives et sélectionnez F480 par rapport à CD11b pour identifier les populations CD11b positives F480 positives et les populations F480 positives CD11b positives.

Créez ensuite une porte fille pour les cellules CD11b positives F480 positives et sélectionnez CX3CR1 par rapport à IA-IE pour identifier à la fois les macrophages associés aux bordures CX3CR1 positifs IA-IE positifs et les macrophages CX3CR1 positifs IA-IE négatifs. Ensuite, créez une porte fille pour les macrophages NÉGATIFs CD11b F480 positifs CX3CR1 positifs IA-IE négatifs et sélectionnez F480 par rapport à CD11b pour identifier à la fois les macrophages icéniques IA-IE négatifs IA-IE négatifs CD11b F480 élevés F480 CX3CR1 positifs CX3CR1 positifs. Ensuite, à partir de la population NÉGATIVE CD11b positive F480, porte pour Ly6C par rapport à IA-IE.

Sélectionnez à la fois la population Ly6C négative positive IA-IE et les cellules Ly6C positives IA-IE négatives qui correspondent principalement à des monocytes ou à des neutrophiles. Enfin, créez une porte fille pour la population Ly6C négative IA-IE positive CD11b F480 négative et sélectionnez CD11b par rapport à CX3CR11. Identifiez ensuite les populations CD11b à CX3CR1 faible et CD11b positif à CX3CR1 négatif.

Pour le contrôle des lymphocytes T, après avoir exclu les cellules DAPI positives comme décrit précédemment, créez une porte fille pour les cellules immunitaires CD45 positives avec CD45 par rapport à FSC-A, puis créez une porte fille à partir des cellules CD45 positives et sélectionnez TCR bêta par rapport à CD11b. Excluez les cellules myéloïdes CD11b positives et sélectionnez la population de cellules T T NÉGATIVES CD11b positives TCR. Enfin, créez une porte fille pour la population CD11b négative bêta positive TCR et sélectionnez CD4 par rapport à CD8a.

Identifier les lymphocytes T CD8 négatifs et CD4 positifs et les lymphocytes T CD4 négatifs CD8 positifs. Les analyses de cytométrie en flux démontrées ici ont révélé avec succès des sous-ensembles majeurs de cellules myéloïdes et T et leur nombre total relatif par souris d’une manière hautement reproductible. L’analyse par cytométrie en flux des cellules myéloïdes montre que le plexus choroïde est peuplé de macrophages CX3CR1 positifs CD11b positifs F480 à bordure élevée, représentant 80% des cellules immunitaires CD45 positives au niveau du plexus choroïde.

La population CD11b CX3CR1 intermédiaire CX3CR1 positive IA-IE négative de CD11b des macrophages épiplexus de Kolmer a également été identifiée. Parmi les cellules immunitaires NÉGATIVES F480 CD11b positives, deux populations différentes de cellules Ly6C négatives IA-IE positives ont été caractérisées et correspondent probablement à des cellules dendritiques. L’analyse et la stratégie de contrôle des lymphocytes T ont mis en évidence la présence de la population mineure de cellules CD45 positives CD11b négatives TCR bêta positives.

Parmi eux, environ 30 à 50 lymphocytes T CD8 négatifs CD4 positifs et CD8 positifs CD4 négatifs par souris ont peuplé le plexus choroïde dans des conditions physiologiques. Il est important de contrôler la qualité de la perfusion car toute contamination du sang peut brouiller la composition immunitaire du plexus choroïde. Cette méthode peut être suivie d’un tri de populations cellulaires sélectionnées pour une analyse plus approfondie telle que le séquençage de l’ARN en vrac ou unicellulaire.