Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées
23 août 2022
Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.
Notre protocole permet l’imagerie simultanée de la dynamique de la microglie et de l’activité neuronale chez la souris éveillée. Il peut être largement appliqué pour étudier le comportement de surveillance de la microglie ou l’interaction avec les neurones. L’avantage de cette méthode est que les artefacts de mouvement ne contaminent pas facilement les données d’imagerie en raison de la fixation robuste de la tête.
De plus, la restauration après l’imagerie à la fréquence d’images élevée nous permet d’éliminer l’artefact de mouvement des données. Dans cette méthode, l’injection d’AAV et la chirurgie d’implantation de fenêtre crânienne sont techniquement exigeantes. L’échec est courant au début, alors s’il vous plaît ne soyez pas frustré et pratiquez plus.
Pour préparer l’appareil d’injection, placer une pipette en verre reliée à une seringue Hamilton de calibre 26 à travers un tube sur un porte-pipette d’un instrument stéréotaxique. Ensuite, inclinez le support de pipette de 60 degrés avant l’axe vertical. Remplissez la pipette en verre, la seringue et le tube de raccordement avec de la paraffine liquide et placez la seringue sur un micro-injecteur.
Administrer l’analgésie à la souris anesthésiée et fixer les barres d’oreille auxiliaires. Ensuite, fixez l’animal sur l’instrument stéréotaxique avec sa face dorsale vers le haut. Après avoir retiré les cheveux du site chirurgical et désinfecté la zone chirurgicale, faites une incision de deux centimètres de long sur le cuir chevelu le long de la ligne médiane, assurant une bonne exposition du crâne au-dessus du cortex visuel primaire droit.
Utilisez une pince pour enlever le périoste sur le crâne exposé. Percez le crâne sur les coordonnées stéréotaxiques trois millimètres latéralement à la ligne médiane et 5 millilitres avant la ligne lambda pour créer un petit trou d’un diamètre d’environ 0,5 millimètres. Ensuite, placez un morceau de film transparent d’environ deux centimètres sur deux centimètres sur le crâne exposé de la souris.
Expulser un microlitre de gouttelette de solution AAV sur le film à l’aide d’un pipetter. Avancez la seringue. Placez une pointe de pipette en verre dans la gouttelette de solution AAV sur le film et tirez doucement la seringue pour aspirer la solution AAV.
Ensuite, insérez la pipette en verre à une profondeur de 500 micromètres de la surface du cerveau à travers le trou créé dans le crâne. Ensuite, injectez 0,5 microlitre de solution AAV à l’aide du micro-injecteur à un débit volumique d’injection de deux microlitres par heure. Retirez l’aiguille et rincez la surface du cerveau avec une solution saline.
Créez une rainure circulaire le long de la marque sur le crâne en perçant. Nettoyez les débris pour assurer la visibilité du crâne et appliquez une solution saline pour éviter l’échauffement pendant le forage. Appuyez doucement sur le crâne central avec une pince.
La profondeur de forage est suffisante s’il se déplace verticalement avec peu de résistance. Lorsque la rainure atteint suffisamment de profondeur, insérez la pointe de la pince dans le bas du fragment de crâne central. Soulevez-le doucement et retirez-le pour exposer la surface du cerveau.
À l’aide d’une aiguille de calibre 27, piquez et déchirez la dure-mère au bord de la surface exposée du cerveau. Insérez l’extrémité de la pince à travers le trou fait au bord de la dure-mère et décollez-la pour exposer la surface du cerveau. Après avoir dispersé les fibres hémostatiques une par une dans une solution saline, placez les fibres hémostatiques le long des bords du trou dans lequel la dure-mère transectée est présente.
Placez la fenêtre crânienne sur la surface exposée du cerveau, puis collez-la au crâne avec de la colle instantanée tout en appuyant doucement sur la fenêtre. Ensuite, appliquez de la colle instantanée sur tout le crâne exposé. Ensuite, attachez soigneusement une plaque de tête sur le crâne pour localiser la fenêtre crânienne au centre du trou carré de la plaque de tête.
Une fois que la colle a suffisamment durci, appliquez du ciment dentaire sur le crâne exposé pour renforcer la fixation entre la tête et la lame de tête. Pour installer le dispositif d’ombrage sur mesure et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle, positionnez d’abord la lentille pour qu’elle se concentre sur la surface du cerveau, puis définissez cette position de lentille sur la position Z d’origine. Gardez les coordonnées XY constantes et élevez l’objectif de l’objectif.
Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête en silicone, en veillant à ce que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage soit bien scellé. Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée.
Ensuite, fixez la souris avec le cadre stéréotaxique sous l’objectif objectif. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif. Couvrez l’objectif avec du papier d’aluminium noir pour éviter la contamination lumineuse du moniteur LCD.
Réglez un moniteur LCD de 10 pouces à 12,5 centimètres devant les yeux de la souris pour présenter des stimuli visuels. Configurez les filtres de collecte de soumission fluorescente pour EGFP et R-CaMP et la longueur d’onde d’excitation à 1 000 nanomètres. Acquérir des images avec une résolution spatiale de 0,25 micron par pixel.
Trouvez la région d’imagerie où les neurones R-CaMP-positifs et la microglie EGFP-positive peuvent être imagés simultanément. Dans la couche 2, 3. Acquérir des images à la fréquence d’images de 30 hertz.
Simultanément à l’acquisition de l’image, présentez des stimuli visuels à la souris dans 12 directions à six orientations, de zéro à 150 degrés par pas de 30 degrés. Après l’acquisition de l’image, retirez la souris de l’étape du microscope. Détachez le dispositif d’ombrage et l’instrument stéréotaxique de la souris et remettez la souris dans sa cage d’origine.
En utilisant ce protocole, l’injection d’AAV et l’implantation de la fenêtre crânienne ont été effectuées dans le cortex visuel primaire d’une souris transgénique âgée de huit semaines, suivies de deux images photoniques de l’activité neuronale basée sur R-CaMP et de la dynamique microgliale dans les couches 2, 3. Des stimuli visuels râpés ont été présentés à la souris et les réponses visuelles dans la colonne vertébrale adendritique ont été analysées à l’aide de traces de calcium. Les processus microgliaux ont montré une dynamique rapide et ont changé leur morphologie en 10 secondes.
En utilisant l’imagerie à deux photons dans la couche 2, 3 du cortex visuel primaire chez une souris transgénique âgée de 12 semaines, R-CaMP a été observé dans les neurones, vu ici en magenta. Un EGFP a été observé dans la microglie, vu en vert. Des signaux individuels ont également été observés pour l’EGFP et le R-CaMP.
Une injection réussie d’AAV est essentielle pour cette méthode. Les principales raisons de l’échec de l’injection d’AAV sont les pipettes en verre de l’horloge et les lésions tissulaires. Le comportement de surveillance sur la microglie et l’interaction microgliale du SNAP ont été identifiés comme étant répandus dans divers mécanismes pathogènes, comme la maladie d’Alzheimer.
Notre méthode est bénéfique pour la recherche axée sur ce domaine.
Aperçu
Cette étude décrit un protocole combinant l'injection de virus adéno-associé (AAV) à l'implantation d'une fenêtre crânienne afin de permettre l'imagerie simultanée de la dynamique des microglies et de l'activité neuronale chez des souris éveillées. Cette méthode permet aux chercheurs d'analyser le comportement de surveillance des microglies et leurs interactions avec les neurones, tout en minimisant les artefacts de mouvement pendant l'imagerie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Imagerie cérébrale
- Neurobiologie
Contexte
- Les microglies jouent un rôle essentiel dans la santé et les maladies du cerveau.
- L'imagerie en temps réel de la dynamique microgliale est cruciale pour comprendre leurs fonctions.
- Les AAV sont couramment utilisés pour délivrer du matériel génétique dans les applications en neurosciences.
- La fixation de la tête chez des souris éveillées réduit les artefacts de mouvement pendant l'imagerie.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'imagerie de l'interaction entre les microglies et les neurones.
- Approfondir la compréhension des dynamiques microgliales et de l'activité neuronale dans des conditions physiologiques.
- Minimiser la contamination des données par des artefacts de mouvement pendant l'imagerie.
Méthodes utilisées
- Le protocole comprend une injection d'AAV et l'implantation d'une fenêtre crânienne dans le cortex visuel primaire de souris éveillées.
- Le modèle biologique est constitué de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes.
- Les étapes clés incluent des coordonnées stéréotaxiques précises pour l'injection et des procédures chirurgicales pour le positionnement de la fenêtre crânienne.
- L'imagerie a été réalisée à l'aide de microscopie à deux photons à une fréquence de trame de 30 Hz.
- Les traces calciques provenant des neurones et des microglies ont été analysées en réponse à des stimuli visuels.
Résultats principaux
- Des dynamiques rapides ont été observées dans les prolongements des microglies, qui modifiaient leur morphologie en moins de 10 secondes.
- Un imagerie simultanée a révélé l'activité neuronale et les dynamiques microgliales en réponse à des stimuli visuels.
- Le protocole a validé l'efficacité des AAV et des fenêtres crâniennes pour une imagerie de haute qualité.
Conclusions
- Cette méthode permet l'observation en temps réel des interactions entre les microglies et les neurones, offrant un aperçu des dynamiques cérébrales.
- L'étude fournit des outils précieux pour comprendre les rôles des microglies dans les mécanismes neuronaux.
- Des applications futures pourraient inclure l'analyse des effets de diverses interventions sur l'activité microgliale et neuronale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie simultanée de la dynamique des microglies et de l'activité neuronale chez des souris éveillées permet une interrogation directe des interactions neuro-immunitaires à une résolution unicellulaire. Cette capacité renforce l'évaluation mécanistique des risques et la confiance prédictive lors de la validation précoce des cibles du SNC, en particulier pour les modèles de maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. L'intégration de lectures en temps réel des interactions gliales-neuronales fait progresser les décisions stratégiques en clarifiant l'engagement des voies et les résultats fonctionnels dans des systèmes pertinentes sur le plan translationnel.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une visualisation directe des interactions microglie-neurone dans des conditions physiologiques et stimulées.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles en associant la dynamique des cellules immunitaires à l'activité neuronale in vivo.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques pour les hypothèses portant sur la neuroinflammation et la plasticité synaptique.
- Améliore la confiance prédictive concernant l'engagement des cibles du SNC et la modulation des voies biologiques.
Développement de tests et criblage
- Établit des systèmes d'imagerie in vivo validés pour l'évaluation quantitative des réponses neuronales et microgliales.
- Fournit des jeux de données reproductibles et minimisant les artefacts de mouvement pour des analyses ultérieures et des criblages.
- Permet la standardisation des protocoles de stimuli visuels et des paramètres d'imagerie pour le développement de tests.
- Facilite une évaluation fiable des effets des composés sur les interactions neuro-immunitaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques avec les mécanismes neuro-immunitaires pertinents observés dans les troubles du système nerveux central humain.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en suivant les réponses cellulaires dynamiques.
- Facilite l'avancement ajusté au risque des programmes de neuroinflammation et de modulation synaptique.
- Fournit des candidats à des biomarqueurs translationnels fondés sur des profils d'activité cellulaire en temps réel.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'imagerie fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant un test fondé sur des hypothèses des interactions neuro-immunitaires chez des souris éveillées et présentant un comportement naturel.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant la surveillance microgliale et la signalisation entre neurones et cellules gliales en réponse à des stimuli périphériques et centraux.
- Criblage : Fournit des données d'imagerie quantitatives et reproductibles, adaptées aux études de perturbation par composés ou approches génétiques.
- Analyse : Fournit des tracés calciques haute résolution et des données morphologiques destinés à l'analyse comparative entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Facilite l'association avec des mécanismes pertinents pour les maladies et le développement de biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme d'imagerie in vivo réutilisable, adaptable à diverses cibles et interventions du système nerveux central.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du SNC.
- Valeur opérationnelle : Standardise les flux de travail d'imagerie in vivo et minimise les artefacts de mouvement pour des données reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et d'avancer de manière économiquement efficace les programmes neuro-immunitaires.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des actifs du SNC fondée sur des preuves fonctionnelles in vivo.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise technique en chirurgie stéréotaxique, administration de virus AAV et implantation de fenêtre crânienne.
- Exige un accès à la microscopie à deux photons et à une infrastructure d'imagerie avancée.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes des protocoles d'imagerie et des analyses de données.
- Peut être adapté à différentes régions cérébrales et modèles transgéniques moyennant une optimisation du protocole.
- Les taux initiaux d'échec technique peuvent être élevés ; la maîtrise s'améliore avec la pratique et l'expérience.
