Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

Commençons par une souris transgénique fixée dans un cadre stéréotaxique, avec une fenêtre crânienne implantée sur son cortex visuel.

La souris exprime l’EGFP dans la microglie et le R-CaMP, un indicateur de calcium fluorescent rouge, dans les neurones du cortex visuel.

Placez la souris sous un microscope à deux photons et ajustez la lentille de l’objectif pour qu’elle se concentre sur la surface du cerveau.

Déplacez la souris avec le cadre stéréotaxique de l’objectif et fixez-y un dispositif d’ombrage.

Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau et repositionnez la souris sous le microscope.

Couvrez l’objectif d’une feuille noire.

Le dispositif d’ombrage et la feuille bloquent les interférences lumineuses externes, assurant une imagerie précise.

Placez un écran LCD devant l’œil de la souris pour fournir une stimulation visuelle.

Réglez les paramètres d’imagerie et commencez l’imagerie.

La stimulation visuelle déclenche l’excitation neuronale, entraînant un afflux de calcium et une augmentation de la fluorescence du R-CaMP.

Pendant ce temps, les microglies rétractent leurs processus tout en interagissant avec les neurones activés, comme observé par imagerie en direct.

Pour installer le dispositif d’ombrage sur mesure et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle, positionnez d’abord la lentille pour qu’elle se concentre sur la surface du cerveau. Et puis définissez cette position de l’objectif comme position z d’origine. Gardez les coordonnées x et y constantes et élevez l’objectif. Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête à l’aide de silicone, en vous assurant que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage est bien scellé.

Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée. Ensuite, fixez la souris avec le cadre stéréotaxique sous l’objectif. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif. Couvrez l’objectif avec une feuille d’aluminium noire pour éviter toute contamination par la lumière de l’écran LCD. Réglez un écran LCD de 10 pouces à 12,5 centimètres devant les yeux de la souris pour présenter des stimuli visuels.

Configurez les filtres de collecte d’émission de fluorescence pour EGFP et RCaMP, et la longueur d’onde d’excitation à 1 000 nanomètres. Acquérez des images avec une résolution spatiale de 0,25 micron par pixel. Trouvez la région d’imagerie où les neurones positifs au RCaMP et la microglie positive à l’EGFP peuvent être imagés simultanément dans la couche 2/3.

Acquérez des images à la fréquence d’images de 30 Hertz. Simultanément, avec l’acquisition d’images, présentez des stimuli visuels de réseau dérivant à la souris dans 12 directions à 6 orientations de 0 à 150 degrés par pas de 30 degrés.