Imagerie in vivo à deux photons de la dynamique microgliale dans l’hippocampe de souris

Prenez une souris transgénique anesthésiée exprimant des protéines fluorescentes dans la microglie. Fixez-le sur un cadre stéréotaxique avec une platine motorisée sous un microscope à deux photons.

Le crâne est équipé d’un tube métallique à fond de verre qui aplatit doucement l’alvéus au-dessus de la région cornu ammonis 1 ou CA1 de l’hippocampe, assurant une interface optique claire sans

pression excessive sur le tissu sous-jacent.

Remplissez le tube métallique avec de l’eau pour optimiser la transmission optique.

Activez le laser pulsé à la longueur d’onde d’excitation.

À l’aide de la fluorescence du parenchyme cérébral et de la lumière réfléchie par le tube métallique, ajustez la mise au point sur la région CA1.

Repositionnez la tête de la souris pour aligner le fond de verre parallèlement au plan d’image, assurant une mise au point uniforme dans tout le champ de vision.

Ajustez l’objectif pour une résolution optimale et observez la dynamique microgliale in vivo dans la région CA1.

Ensuite, imaginez le gyrus denté, où la microglie fluorescente confirme l’intégrité de CA1.

Placez la souris dans le dispositif de maintien de la tête sous l’objectif du microscope à deux photons et sur la platine de balayage XY motorisée. Remplissez ensuite l’espace entre le fond en verre et la lentille de l’objectif avec de l’eau sans créer de bulles d’air. Ajustez la mise au point, à CA1, avec le guidage de la fluorescence émise par le parenchyme cérébral et de la lumière réfléchie par le bord du tube métallique, sous un éclairage continu par le laser pulsé.

Ajustez l’angle de la tête de la souris en inclinant le dispositif de maintien de la tête de sorte que le fond en verre soit parallèle au plan d’imagerie. Ensuite, ajustez le collier de correction de l’objectif pour obtenir la résolution la plus élevée à une profondeur de la structure cible dans le CA1. Ensuite, confirmez que les cellules fluorescentes de la couche moléculaire du gyrus denté, ou DG, à une profondeur de 500 micromètres du fond du verre, sont imagées dans tout le champ de vision. Ce n’est qu’en cas de réussite de l’opération que les signaux DG peuvent être détectés immédiatement.

S’assurer que les microglies ont retrouvé leur morphologie ramifiée. Réalisez ensuite une imagerie in vivo sur la couche d’intérêt dans le CA1.