Name: Simultanée à deux photons In Vivo Imagerie dentrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Découvrez la craniotomie pour l'imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris par microscopie biphotonique in vivo. Cette méthode permet le suivi longitudinal de la plasticité structurale neuronale.

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Les auteurs tiennent à remercier M. Steczkowski pour les enregistrements vocaux, M. Borczyk pour les dessins, A. Trąbczyńska pour la production de virus, M. Ziókowska pour le génotypage et A. Mirgos de l&#39;aide pour le tournage. KR reconnaît le genre don du virus recombinant adéno-associé (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur de CaMK de K. Deisseroth. Ce projet a été réalisé dans les installations de base de laboratoire de modèles animaux et de laboratoire de la structure des tissus et de la fonction, Centre de neurobiologie, Nencki Institut de biologie expérimentale, avec l&#39;utilisation de l&#39;infrastructure CePT financé par l&#39;Union européenne - le Fonds européen de développement régional au sein le programme opérationnel «économie innovatrice» pour la période 2007-2013. Ce travail a été soutenu par des subventions du Centre national des sciences: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 à KR et Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local à l&#39;Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences. Note: Certaines des scènes dans la vidéo associée sont accélérés. Facteur de vitesse est indiqué dans ces scènes. 1. Chirurgie Préparation <ol><li> Stériliser tous les outils, les récipients en verre pour les liquides et les tampons de coton dans l&#39;autoclave. Utiliser des gants dispensables. Nettoyer la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec 70% d&#39;éthanol. Utiliser un tampon chirurgical stérile pour créer un espace stérile pour tout l&#39;équipement stérilisé. Couper Gelfoam en petits morceaux et les faire tremper dans une solution saline stérile. Remarque: Selon le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, l&#39;éthanol est ni un stérilisant ni un désinfectant de haut niveau. Il ne doit être utilisé comme agent de nettoyage / de dégraissage sur des surfaces préalablement stérilisés. </li><li> Mettre l&#39;animal dans echambre d&#39;induction de e et définir le niveau de l&#39;isoflurane à 5% et le débit d&#39;oxygène à 2 L / min. Cette procédure devrait prendre environ 3 min. </li><li> Prenez l&#39;animal hors de la chambre d&#39;induction. Utilisez la queue ou orteil pincements afin de veiller à ce que l&#39;animal est complètement sous sédation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un trimmer précis raser les cheveux à l&#39;arrière de la tête (entre les oreilles) jusqu&#39;aux yeux. </li><li> Placer l&#39;animal dans le cadre stéréotaxique et à stabiliser la tête avec des barres d&#39;oreilles. </li><li> Définir les niveaux d&#39;anesthésie à 1,5-2% d&#39;isoflurane et de 0,3 L / min d&#39;oxygène. </li><li> Appliquer la pommade oculaire. </li><li> Injecter le animale sous-cutanée avec Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) et Baytril (5 mg / kg) pour prévenir l&#39;inflammation, de la douleur et de l&#39;infection, respectivement. </li><li> Injecter la voie intramusculaire des animaux avec la dexaméthasone (0,2 mg / kg) pour empêcher un gonflement du cerveau. Note: Il est possible d&#39;injecter dexaméthasone sous - cutanée ou intrapéritonéale pour prévenir les dommages musculaires. </li><li> Nettoyer la peau à l&#39;aide dedes tampons de coton avec de la bétadine terile suivies de 70% d&#39;éthanol. </li><li> Changez les gants et les pulvériser avec 70% d&#39;éthanol. Remarque: Lors de l&#39; utilisation des gants jetables ne pas toucher le champ stérile. Touchez l&#39;animal seulement avec les pointes des instruments chirurgicaux stériles et des écouvillons stériles. </li></ol> Chirurgie 2. Cranial Fenêtre <ol><li> Soulever la peau avec une pince et l&#39;aide de micro ciseaux incise la peau horizontalement le long de la base de la tête, puis oblique vers le point de front entre les yeux. Retirez le lambeau de peau. </li><li> Appliquer une pommade lidocaïne avec un écouvillon stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur. </li><li> Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour enlever le périoste. Sécher le crâne avec des écouvillons stériles. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser afin de prévenir tout contact avec le ciment dentaire. Attendez que la colle sèche. </li><li> Posez une stérile de 3 mm sur lamelle til crâne en avant de la suture lambdoïde. Centre de la lamelle au RSC coordonne: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marquez les bords de lamelle en grattant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Mettez la lamelle dans le récipient stérile avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Utilisez une perceuse dentaire à haute vitesse avec une petite fraise de diamètre pour décrire un cercle de 3 mm de diamètre. Nettoyer le site de forage à partir de la poussière d&#39;os avec une solution saline stérile écouvillons trempés. Utilisez le Gelfoam et tampons pour arrêter le saignement occasionnel et nettoyer l&#39;os. </li><li> Entre forage vérifier l&#39;épaisseur de l&#39;os avec une pince fine en touchant légèrement le cercle d&#39;os et de vérifier sa mobilité. Gardez à l&#39;esprit que l&#39;os est plus épaisse sur la zone de la suture. Arrêtez le forage lorsque le cercle des os est mobile et seulement encore, mince couche d&#39;os est laissé sur la circonférence. Nettoyez le champ opérationnel de tout le reste de la poussière de l&#39;os avec une solution saline trempé écouvillons. </li><li> Déposez la solution saline stérile sur la zone de forage, couvrant la cir forécle. Retirez délicatement le cercle de l&#39;os avec une pince fine et puis doucement mais fermement retirer l&#39;os en le soulevant vers le haut. Veillez à ne pas fausser le cercle de l&#39;os en le soulevant pour éviter d&#39;endommager la dure. </li><li> Appliquez doucement le Gelfoam trempé dans une solution saline stérile sur la dure-mère pour aider à arrêter le saignement. Attendre jusqu&#39;à ce que tout saignement est complètement arrêté. Retirez délicatement le Gelfoam de ne pas perturber le processus de coagulation. Remarque: La zone de suture est très vascularisé, de sorte que le saignement à ce point pourrait se révéler être profonde. Il est essentiel d&#39;attendre que le temps suffisant pour que le saignement cesse complètement. Il est utile de garder le Gelfoam saline imbibés refroidi en le plaçant sur la glace. </li></ol> 3. Virus Injection <ol><li> Fixer la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connecter le contrôleur. </li><li> Insérez l&#39;aiguille 35G dans la seringue. Rincer la seringue 10 fois avec de l&#39;éthanol pour la stériliser et 10 fois avec une solution saline stérile pour éliminer les traces d&#39;ethanol. Retirer les bulles d&#39;air de la seringue. Insérer la seringue dans la pompe. Remarque: Pensez à utiliser d&#39;autres désinfectants. </li><li> Décongeler une dose unique de rAAV2 / 1 mCherry préparation (10 12 pfu est recommandé) et le garder sur la glace. Remplir la seringue avec la solution de virus. </li><li> Centrer l&#39;aiguille sur le bregma, puis insérez doucement dans l&#39;hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Ces coordonnées seront situés près du bord de la craniotomie. Attendez 5 min pour le tissu se stabiliser. </li><li> Injecter 0,7 pl de la solution rAAV2 / 1 mCherry au taux de 50 nl / min. Attendre 10 min pour que le virus adsorber pleinement. Retirez délicatement l&#39;aiguille. Éponger avec Gelfoam si le saignement se produit. Répéter avec le site controlatéral. </li></ol> 4. Cranial fenêtre Implantation <ol><li> Poser le, lamelle stérile séchée sur le dessus de la dure-mère dans le cadre du cercle percé. Tenir la lamelle avec le forcEPS pour aplatir légèrement la dure-mère et amener coverglass &#39;des bords plus proche de la surface du crâne. Remarque: Il est possible que la lamelle perturbe le caillot et les curriculum vitae de saignement. Si tel est le cas, soulever la lamelle, placez-le dans l&#39;alcool, sec et revenir à l&#39;étape 2.9. </li><li> En utilisant une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la lamelle de les attacher au crâne. Attendez que la colle sèche. </li><li> Placez une barre de fixation (M2 écrou ou une conception sur mesure) dans la partie avant du crâne. Appliquer la colle cyanoacrylate sur les bords de la barre. Attendez que la colle sèche. <ol><li> Placez la barre de fixation dans une position qui permettra un positionnement horizontal de la fenêtre crânienne lors de l&#39;imagerie session. Placez-le aussi éloigné que possible de la fenêtre. Si elle est placée trop près de la fenêtre, la barre et la vis de connexion avec le support sur mesure pourrait poser comme un obstacle à l&#39;objectif au cours du processus d&#39;imagerie. </li></ol></li><li&gt; Préparer l&#39;acrylique dentaire et l&#39;appliquer sur la surface du crâne autour du verre. Il est utile de former une forme de cratère dans la fenêtre. Il va créer une cavité pour l&#39;eau appliquée plus tard pour l&#39;imagerie avec l&#39;objectif de l&#39;eau. </li><li> Créer un bouchon avec l&#39;acrylique dentaire, couvrant le reste de la zone opérationnelle, les bords de la peau, barre de fixation, ce qui renforce le cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire à durcir. </li><li> Retirer l&#39;animal du cadre stéréotaxique et le mettre dans la chambre de récupération. </li><li> Attendez que l&#39;animal de récupérer de la chirurgie tout en observant les fonctions physiologiques. </li><li> Appliquer l&#39;analgésie post-opératoire (carprofène, 10 mg / kg) et le traitement des antibiotiques (Baytril, 5 mg / kg) pendant 48 heures. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Démarrez le laser Ti: saphir, la mise sous tension du microscope. Le système utilisé dans cette expérience est équipée d&#39;un laser à deux photons, un système à double BOA et GaAsP PMT. </li><li> Mettre l&#39;animal dans le inducchambre de tion et induire une anesthésie. </li><li> Retirer l&#39;animal de la chambre d&#39;induction et place dans le masque d&#39;anesthésie de gaz sous le microscope. Diminuer le débit d&#39;oxygène à 0,3 L / min et la concentration d&#39;isoflurane à 1,5-2%. </li><li> Fixer l&#39;animal sur le cadre de microscope personnalisé avec une vis M2 (ou un autre système personnalisé). Niveau de la fenêtre crânienne. Remarque: Il est possible d&#39;utiliser le système tête de fixation du fabricant de microscope, bien que le cadre personnalisé spécifique donne de meilleurs résultats (amélioration de la stabilité de la tête, le positionnement constant dans plusieurs sessions au cours d&#39; une expérience chronique). </li><li> En utilisant les réglages du microscope Widefield et un centre objectif faible grossissement de la vue sur l&#39;un des côtés du cortex rétrosplénial et de se concentrer sur la surface de la lamelle. </li><li> Appliquer une goutte d&#39;eau dans le puits acrylique cratère. Basculer vers un objectif d&#39;immersion dans l&#39;eau à longue distance. Déplacer l&#39;objectif vers la fenêtre crânienne jusqu&#39;à ce que le ménisque de l&#39;eau conconnecte l&#39;échantillon et objectif. </li><li> Passez aux réglages à deux photons et commencer à numériser le sommet de l&#39;échantillon vers le bas en utilisant le plus bas zoom. La traversée de la dure-mère sera visible comme un éclat de haute signal non spécifique. </li><li> Réglez les paramètres d&#39;acquisition du microscope dans les deux canaux (GFP et mCherry) selon la puissance du signal à partir de cellules fluorescentes afin de couvrir toute la gamme dynamique. </li><li> Après avoir trouvé un neurone approprié (avec l&#39;arbre dendritique séparés des autres cellules) effectuer une analyse initiale en utilisant uniquement le filterset GFP avec zoom plus bas et z-distance de 5 microns. </li><li> Obtenir une projection maximale de la pile numérisée et l&#39;imprimer pour les annotations (en utilisant des couleurs inversées). </li><li> Réglez le zoom sur une valeur qui permettra à l&#39;image les détails morphologiques souhaités. Image l&#39;ensemble de l&#39;arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry utilisant la projection maximale de guide. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs (KL, MR, KR) ont des droits de brevet en instance (PL410001) pour cadre porteur utilisé dans le présent article.

Dans le présent document , nous présentons un protocole pour l&#39;utilisation simultanée de deux photons dans l&#39; imagerie in vivo des entrées synaptiques et des cibles postsynaptiques dans RSC à travers une fenêtre crânienne. La procédure d&#39;implantation se composent de plusieurs étapes clés. Tout d&#39;abord, l&#39;animal est profondément anesthésié et fixé dans le cadre stéréotaxique, puis le crâne sur le RSC est amincie avec un foret le long des lignes circulaires marquées et l&#39;os circul...

La microscopie à deux photons a révolutionné l&#39;observation de l&#39;activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l&#39; une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l&#39; examen de nombreux aspects de l&#39; activité cérébrale in vivo 1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l&#39; activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant de laboratoires utilisent des microscopes à deux photons, la mise en œuvre de la technique à travers le monde scientifique comme une nouvelle norme pour l&#39;imagerie in vivo du cerveau. L&#39;approche standard consiste à l&#39; implantation de la fenêtre crânienne (un trou rond dans le crâne recouvert d&#39;un couvercle en verre) sur le canon ou le cortex visuel du cerveau de la souris 3. Ensuite, selon le protocole expérimental, le MOUSE subit une série de visualisation et des séances de formation de comportement, ce qui permet de suivre l&#39;évolution de l&#39;activité du cerveau et de la morphologie neuronale au cours du temps 4,5. Dans les deux cas, la craniotomie affecte uniquement l&#39;os pariétal, sans traverser les sutures. Il est notoire que le principal inconvénient de cette technique est limitée à son application cortexes facilement accessible tel que le canon ou le cortex visuel. Implantation de la fenêtre crânienne par rapport aux autres régions pose beaucoup de difficultés, en raison de saignements excessifs et / ou entrave spatiale. Dans cet article , nous proposons l&#39;implantation de la fenêtre crânienne au- dessus du cortex rétrosplénial (RSC) comme une autre région d&#39;intérêt possible pour les deux photons en microscopie in vivo 6. RSC est un élément important du circuit responsable de la formation de la mémoire spatiale du cerveau. Anatomiquement, RSC est une partie d&#39;un réseau neuronal de connexion corticale, hippocampique et régions thalamiques 7. C&#39;estfortement impliqué dans une gamme de comportements, tels que l&#39; apprentissage spatial et de l&#39; extinction, ainsi que la navigation spatiale 6. Afin de visualiser les changements morphologiques des neurones , nous utilisons une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de Thy1. Chez ces souris, la GFP est exprimée dans environ 10% des neurones dans le cerveau permettant une visualisation claire des axones et des dendrites corticaux utilisant microscopie à deux photons 8. Une autre innovation que nous proposons est l&#39;injection d&#39;un virus adéno-associé recombinant de sérotype 01/02 (rAAV2 / 1) codant pour une protéine fluorescente rouge (mCherry) sous une CaMKII promoteur spécifique des neurones 9 dans les structures plus profondes du cerveau faisant saillie vers le RSC telles que l&#39;hippocampe. L&#39;expression de rAAV2 / 1 mCherry dans l&#39;hippocampe de souris Thy1-GFP permet la visualisation simultanée des éléments de pré- et post - synaptiques de la hippocampo-cortical synapses 10. L&#39;expression rAAV mécanique de mCherry nécessite deux à trois semaines pour la protéine d&#39;atteindre un niveau suffisant dans les terminaisons axonales. Cette période est conforme à l&#39;heure habituelle nécessaire pour la récupération de craniotomie.

<table><tbody><tr><td><Médicament fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2 % préopératoire</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2 % pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg intramusculaire</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg par voie sous-cutanée</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg par voie sous-cutanée</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg par voie sous-cutanée</td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg par voie sous-cutanée</td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>par voie topique</td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>par voie topique</td></tr><tr><td><fort>Chirurgie</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dentaire ; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>colle topique</td></tr><tr><td>CA</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental</td><td>acrylique SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Appareil</td><td>HSE-64-0720</td> Foret dentaire <td>de 3 mm de diamètre</td></tr><tr><td></td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Barre de fixation</td> Des écrous de vis <td>N/A</td><td>M2 ou M3 sur mesure peuvent être utilisés</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder Cadre de support</td> Microscope à deux photons <td>N/A</td><td></td><td>sur mesure</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Unité laser : Coherent Chameleon 690-1040nm avec oscillateur paramétrique optique 1050-1300nm. Objectifs : EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 et LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Détection : les filtres passe-bande Zeiss BP 500-550 (GFP) et BP 570-610 (mCherry) séparés par un séparateur de faisceau à 560 nm et couplés à deux photodétecteurs GaAsP.</td></tr>Cadeau du virus <tr><td><></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>de K. Deisseroth</td><td></td><td>Virus adéno-associé recombinant (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur CaMK</td></tr></tbody></table>

simultanée à deux photons<em&gt; in vivo</em&gt; imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le cortex souris rétrosplénial

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones du cortex rétrosplénial (RSC) de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée de souris transgéniques Thy1-GFP. Cette approche permet d’étudier la corrélation entre les manipulations comportementales et les modifications de la morphologie neuronale in vivo.
La procédure d’implantation de la fenêtre crânienne a été considérée comme limitée uniquement aux régions du cortex facilement accessibles telles que le champ du tonneau. Notre approche permet de visualiser les neurones dans le RSC hautement vascularisé. La RSC est un élément important du circuit cérébral responsable de la mémoire spatiale, auparavant considéré comme problématique pour l’imagerie à deux photons in vivo.
L’implantation de la fenêtre crânienne sur le RSC est associée à une injection du virus adéno-associé recombinant exprimant mCherry (rAAVmCherry) dans l’hippocampe dorsal. La mCherry exprimée se propage aux projections axonales de l’hippocampe vers la RSC, permettant de visualiser les changements dans les boutons axonaux présynaptiques et les épines dendritiques postsynaptiques dans le cortex. 
Cette technique permet de surveiller à long terme la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

L&#39;expression de la GFP dans un sous - ensemble de neurones dans le reporteur souris Thy1-GFP permet l&#39;imagerie in vivo des dendrites corticales et les projections axonales locales dans le RSC. La figure 1A montre la projection maximale d&#39;une pile d&#39;images avec de multiples dendrites GFP-positives visibles. Le corps cellulaire est obscurcie par une artère. Figure 1B montre une image plane unique zoom (zoom numérique 3x) de la bran...

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité d'éthique local de l'Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences. Cette vidéo montre une procédure de craniotomie permettant l'imagerie chronique des neurones du cortex rétrosplénial de la souris à l'aide de la microscopie à deux photons in vivo chez la lignée transgénique thi one-G of feet. Cette approche est combinée à l'injection d'un virus adéno-associé exprimant mCherry, AAV, dans l'hippocampe dorsal.Combinées, ces techniques permettent une surveillance à long terme de la dépendance acquise et de la plasticité structurelle dans le cortex rétrosplénial. Dans cet article, nous proposons l'implantation d'une fenêtre crânienne au-dessus du cortex rétrosplénial comme région d'intérêt possible pour la microscopie in vivo à deux photons. Afin de visualiser les changements morphologiques dans les structures neuronales, nous utilisons des souris Thy1-GFP dans lesquelles environ 10 pour cent des neurones expriment la protéine fluorescente GFP.Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un AAV, exprimant une protéine fluorescente mCherry sous un promoteur spécifique aux neurones, dans des structures cérébrales profondes, telles que l'hippocampe, afin de visualiser les projections de cette structure vers le cortex rétrosplénial. Stérilisez tous les outils, récipients en verre pour liquides et cotons-tiges dans l'autoclave. Vous portez des gants jetables.Nettoyez la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez un champ opératoire stérile pour créer un espace stérile destiné à tout l'équipement stérilisé. Coupez la mousse en gel en petits morceaux et imbibez-les de sérum physiologique stérile.Placer l'animal dans la chambre d'induction et régler le niveau d'isoflurane à 5 % et le débit d'oxygène à deux litres par minute. Cette procédure doit prendre environ trois minutes. Sortir l'animal de la chambre d'induction.Utilisez des pressions légères sur la queue ou les orteils pour vous assurer que l'animal est complètement sédé. À l’aide de ciseaux précis, rasez les poils à l’arrière de la tête, entre les oreilles, jusqu’aux yeux. Placez l’animal dans le cadre stéréotaxique et stabilisez la tête à l’aide de barres auriculaires.Régler les niveaux d'anesthésie sur 1,5 à 2 % d'isoflurane et 0,3 litre par minute d'oxygène. Appliquer la pommade ophtalmique. Injecter à l'animal par voie sous-cutanée du tolfédine, 4 milligrammes par kilogramme, du butomidore, 2 milligrammes par kilogramme, et du Baytril, 5 milligrammes par kilogramme, afin de prévenir respectivement l'inflammation, la douleur et l'infection.Injecter l'animal par voie intramusculaire avec du dexaméthasone, zéro virgule deux milligramme par kilogramme, afin de prévenir un gonflement cérébral. Nettoyer la peau à l'aide de cotons-tiges stériles imbibés de bétadine, suivis d'éthanol à 70 %. Changer les gants et les pulvériser avec de l'éthanol à 70 %.Soulevez la peau avec une pince et, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, incisez horizontalement la peau à la base de la tête, puis obliquement jusqu’au point frontal situé entre les yeux. Retirez le lambeau de peau. Appliquez une pommade à la lidocaïne à l’aide d’un applicateur stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur.Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour retirer le périoste. Séchez le crâne avec des cotons stériles. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez une colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser et éviter tout contact ultérieur avec le ciment dentaire.Attendre que la colle sèche. Placer un verre de couverture stérile de trois millimètres sur le crâne, en avant de la suture lambdoïde. Centrer le lamelle aux coordonnées rétrospléniennes, antérieur-postérieur bregma moins deux virgule huit, médial-latéral bregma zéro.Marquer les bords du lamelle en rayant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Remettre le lamelle dans le récipient stérile contenant de l'éthanol à 70 %. Utiliser une fraise dentaire à grande vitesse avec une fraise de petit diamètre pour tracer un cercle de trois millimètres de diamètre.Nettoyer le site de perçage de la poussière osseuse à l’aide de compresses stériles imprégnées de solution saline. Utiliser la mousse en gel et les compresses pour arrêter les saignements occasionnels et nettoyer l’os. Entre les phases de perçage, vérifier l’épaisseur de l’os à l’aide de fines pinces en touchant délicatement le pourtour osseux et en évaluant sa mobilité.Tenez compte du fait que l'os est plus épais au niveau des sutures. Arrêtez le perçage lorsque le cercle osseux est mobile et qu'une couche mince et uniforme d'os subsiste uniquement sur le pourtour. Nettoyez le champ opératoire de toute la poussière osseuse résiduelle à l’aide de compresses imbibées de sérum physiologique.Déposer le sérum physiologique stérile sur la zone de perçage, en recouvrant le cercle percé. Soulever délicatement le cercle osseux à l’aide d’une pince fine, puis retirer l’os doucement mais fermement en le soulevant vers le haut. Veiller à ne pas tordre le cercle osseux lors de son retrait afin d’éviter tout dommage possible à la dure-mère.Appliquez délicatement la mousse de gel imbibée de sérum physiologique stérile sur la dure-mère afin d'aider à arrêter le saignement. Attendez jusqu'à ce que tout saignement soit complètement interrompu. Retirez soigneusement la mousse de gel sans perturber le processus de coagulation.Remarquez que la zone de suture est fortement vascularisée, de sorte que le saignement à ce niveau pourrait être abondant. Il est essentiel d'attendre un temps suffisant pour que le saignement cesse. Fixez la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connectez le contrôleur.Insérez l'aiguille de calibre 35 dans la seringue de remplissage. Rincez la seringue 10 fois avec de l'éthanol pour la stériliser, puis 10 fois avec du sérum physiologique stérile pour éliminer toute trace d'éthanol. Éliminez les bulles d'air de la seringue.Insérez la seringue dans la pompe. Remplissez une dose unique de préparation AV et conservez-la sur glace. Remplissez la seringue avec la solution virale.Positionnez l'aiguille au niveau du bregma, puis insérez-la délicatement dans l'hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes : antérieur, postérieur moins deux, médial latéral plus ou moins un, dorsal ventral moins un. Ces coordonnées se situent près du bord du domaine crânien. Attendez cinq minutes pour permettre la stabilisation du tissu.Injecter 0,7 µL de solution AV à un débit de 50 nL par minute. Attendre 10 minutes pour permettre une absorption complète du virus. Retirer délicatement l'aiguille.Appliquez une compresse en mousse de gel en cas de saignement. Répétez l’opération du côté controlatéral. Placez le verre de couverture stérile et sec sur la dure-mère, à l’intérieur du cadre circulaire percé.Tenez le verre de couverture avec la pince pour aplatir doucement la dure-mère et rapprocher les bords du verre de couverture de la surface du crâne. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez une colle cyanoacrylate dense sur les bords du verre de couverture afin de les fixer au crâne. Attendez que la colle sèche.Placer une barre de fixation, un écrou Anton ou un modèle personnalisé sur la partie antérieure du crâne. Remarque : la barre de fixation doit être positionnée de manière à permettre un alignement horizontal de la fenêtre crânienne pendant la séance d'imagerie. Appliquer la colle sur les bords de la barre.Attendez que la colle sèche. Remarque : la barre de fixation doit être placée aussi loin que possible de la fenêtre. Si elle est placée trop près de la fenêtre, la barre et la vis qui la relie au support sur mesure pourraient gêner l'objectif pendant le processus d'imagerie.Préparez l'acrylique dentaire et appliquez-le sur la surface du crâne autour du verre. Il est utile de former une forme en forme de cratère autour de la fenêtre. Cela créera une cavité pour l'eau appliquée ultérieurement lors de l'imagerie avec l'objectif à immersion dans l'eau.Créez un capot avec l'acrylique dentaire, recouvrant le reste des bords de la zone opératoire et la barre de fixation de la peau, en renforçant le pourtour du cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire durcisse. Retirez l'animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans la chambre de récupération.Attendre que l'animal se remette de l'intervention chirurgicale tout en surveillant les fonctions physiologiques. Appliquer un traitement postopératoire d'anesthésie au cyroproferrin, 10 milligrammes par kilogramme, et un traitement antibiotique au baytril, 5 milligrammes par kilogramme, pendant 48 heures. Démarrer le laser Ti:saphir, puis mettre sous tension le microscope.Le système utilisé dans cette expérience est équipé d'un laser à deux photons, d'un système OPO et de deux PMT au gallium arseniure falsifiés. Placez l'animal dans la chambre d'induction et induisez l'anesthésie. Retirez l'animal de la chambre d'induction et placez-le sous le masque d'anesthésie gazeuse sous le microscope.Réduire le débit d'oxygène à 0,3 litre par minute et la concentration d'isoflurane à 1,52 %. Fixer l'animal au support microscopique sur mesure à l’aide d’une vis MT ou d’un autre système personnalisé. Niveler la fenêtre crânienne. Remarque : il est possible d’utiliser le système de fixation de la tête fourni par le fabricant du microscope, bien que le support sur mesure spécifique offre de meilleurs résultats, une stabilité accrue de la tête et un positionnement constant lors de plusieurs séances au cours d’une expérience chronique.À l'aide des paramètres du microscope à grand champ, utilisez un objectif de faible grossissement pour centrer la vue sur l'un des côtés du cortex rétrosplénial et faites la mise au point sur la surface de la lamelle. Appliquez une goutte d'eau dans le puits en acrylique de forme creusée. Passez à un objectif à immersion dans l'eau à longue distance.Déplacez l'objectif vers la fenêtre crânienne jusqu'à ce que le ménisque d'eau relie l'échantillon et l'objectif. Passez aux paramètres de bi-photons et commencez à balayer l'échantillon de haut en bas en utilisant le zoom le plus faible. Le franchissement de la dure-mère sera visible sous forme d'un reflet produit par un signal non spécifique élevé.Ajustez les paramètres d'acquisition du microscope sur les deux canaux, GFP et mCherry, en fonction de l'intensité du signal provenant des cellules fluorescentes afin de couvrir toute la plage dynamique. Après avoir identifié un neurone approprié dont l'arborisation dendritique est séparée des autres cellules, effectuez un balayage initial en utilisant uniquement les filtres GFP avec le zoom le plus faible et une distance Z de cinq micromètres. Obtenez une projection maximale de la pile de balayage et imprimez-la pour y ajouter des annotations en utilisant des couleurs inversées.Régler le zoom à une valeur permettant d’imager les détails morphologiques souhaités. Imager tout l’arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry en utilisant une projection maximale comme guide. Grâce à ce protocole, il sera possible de surveiller de façon répétée les structures pré- et post-synaptiques dans le cortex rétrosplénial.Cette approche pourrait être utilisée dans le cadre d'une expérience chronique où des manipulations comportementales sont censées être corrélées à des changements dans la morphologie des dendrites, des épines synaptiques ou des neurones pré-synaptiques. Les séances d'imagerie peuvent être réalisées à n'importe quelle fréquence, mais un intervalle de 24 heures est préféré afin de permettre une récupération adéquate de l'animal et de minimiser l'effet de l'anesthésie. Si elle est correctement appliquée, cette technique permet d'effectuer plusieurs séances d'imagerie sur une période de plusieurs mois.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

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Source : Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocamp. J. Vis. Exp. (2022)La vidéo montre la configuration et le processus d’imagerie pour la microscopie à deux photons in vivo de la dynamique microgliale dans l’hippocampe CA1 (Cornu ammonis 1) et le gyrus denté, assurant un alignement optique optimal et une évaluation de l’intégrité structurelle.

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