Simultanée à deux photons In Vivo Imagerie d'entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité d’éthique local de l’Institut Nenscki de biologie expérimentale de l’Académie polonaise des sciences. Cette vidéo montre une procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de la souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans cette ligne transgénique d’un G de pieds. Cette approche est associée à l’injection de mCherry exprimant le virus adéno-associé, AAV, dans l’hippocampe dorsal.

Combinées ensemble, ces techniques permettent un suivi à long terme de la dépendance vécue, de la plasticité structurelle dans le cortex rétrosplénien. Dans cet article, nous proposons l’implantation de la fenêtre crânienne au-dessus du cortex rétrosplénial comme n’étant pas une région d’intérêt possible pour la microscopie in vivo à deux photons. Afin de visualiser les changements morphologiques dans les structures neuronales, nous utilisons ce one-G de souris B avec l’expression de la protéine GFP fluorescente dans environ 10 % des neurones du cerveau.

Une autre innovation que nous proposons est l’injection d’un AAV, expression d’une protéine fluorescente mCherry sous un promoteur spécifique aux neurones dans les structures plus profondes du cerveau, telles que l’hippocampe, afin de visualiser les projections de la structure dans le cortex rétrosplénial. Stérilisez tous les outils, les récipients en verre pour les liquides et les cotons-tiges dans l’autoclave. Vous avez des gants superflus.

Nettoyez la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez un tampon chirurgical stérile pour créer un espace stérile pour tout le matériel stérilisé. Coupez la mousse de gel en petits morceaux et trempez-les dans une solution saline stérile.

Mettez l’animal dans la chambre d’induction et réglez le niveau d’isoflurane à 5 % et le débit d’oxygène à deux litres par minute. Cette procédure devrait prendre environ trois minutes. Sortez l’animal de la chambre d’induction.

Utilisez des pincements de la queue ou des orteils afin de vous assurer que l’animal est complètement sédatif. À l’aide d’une tondeuse précise, rasez les cheveux de l’arrière de la tête, entre les oreilles, jusqu’aux yeux. Placez l’animal dans le cadre stéréotaxique et stabilisez la tête avec des barres d’oreille.

Réglez les niveaux d’anesthésie à 1,5 à 2 % d’isoflurane et à trois litres d’oxygène par minute. Appliquez la pommade pour les yeux. Injectez à l’animal par voie sous-cutanée de la tolfédine, quatre milligrammes par kilogramme, du butomidor, deux milligrammes par kilogramme, et du Baytril, cinq milligrammes par kilogramme pour prévenir l’inflammation, la douleur et l’infection respectivement.

Injectez à l’animal par voie intramusculaire de la dexaméthasone, zéro virgule deux milligrammes par kilogramme, pour prévenir l’enflure du cerveau. Nettoyez la peau à l’aide de cotons-tiges stériles avec de la bétadine suivie de 70 % d’éthanol. Changez les gants et vaporisez-les avec de l’éthanol à 70 %.

Soulevez la peau à l’aide d’une pince et, à l’aide de microciseaux, incisez la peau horizontalement le long de la base de la tête, puis obliquement vers l’avant entre les yeux. Retirez le rabat de peau. Appliquez la pommade à la lidocaïne avec un écouvillon stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur.

Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour retirer le périoste. Séchez le crâne avec des écouvillons stériles. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez de la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser et éviter tout contact ultérieur avec le ciment dentaire.

Attendez que la colle sèche. Posez un verre de couverture stérile de trois millimètres sur le crâne en avant de la suture lambdoïde. Centrer la lamelle de couverture aux coordonnées rétrospléniales, antérieure, postérieure bregma moins deux virgule huit, bregma latérale médiale zéro.

Marquez les bords de la lamelle en grattant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Remettez le verre de couverture dans le récipient stérile contenant de l’éthanol à 70 %. Utilisez une perceuse dentaire à grande vitesse avec une fraise de petit diamètre pour tracer un cercle de trois millimètres de diamètre.

Nettoyez le site de forage de la poussière d’os à l’aide d’écouvillons stériles à bout salin. Utilisez la mousse de gel et les écouvillons pour arrêter les saignements occasionnels et nettoyer l’os. Entre les forages, vérifiez l’épaisseur de l’os à l’aide d’une pince fine en touchant doucement le cercle osseux et en vérifiant sa mobilité.

En gardant à l’esprit que l’os est plus épais sur la zone des sutures. Arrêtez le forage lorsque le cercle osseux est mobile et qu’il ne reste qu’une fine couche uniforme d’os sur la circonférence. Nettoyez le champ de fonctionnement de toute la poussière d’os restante à l’aide d’écouvillons à pointe saline.

Déposez la solution saline stérile sur la zone de forage, en couvrant le cercle percé. Faites délicatement levier sur le cercle d’os à l’aide d’une pince fine, puis retirez doucement mais fermement l’os en le soulevant vers le haut. Veillez à ne pas incliner le cercle de l’os tout en le soulevant pour éviter d’endommager la dure-mère.

Appliquez délicatement la mousse de gel imbibée de solution saline stérile sur la dure-mère pour aider à compléter le saignement. Attendez que tout saignement soit complètement arrêté. Retirez soigneusement la mousse de gel pour ne pas perturber le processus de coagulation.

Notez que la zone de suture est très vascularisée, de sorte que le saignement à ce stade peut s’avérer profond. Il est essentiel d’attendre le temps suffisant pour que le saignement s’arrête. Fixez la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connectez le contrôleur.

Insérez l’aiguille de calibre 35 dans la seringue de remplissage. Rincez la seringue 10 fois avec de l’éthanol pour la stériliser et 10 fois avec une solution saline stérile pour éliminer les traces d’éthanol. Retirez les bulles d’air de la seringue.

Insérez la seringue dans la pompe. Remplissez une seule dose de préparation AV et conservez-la sur de la glace. Remplissez la seringue avec une solution antivirus.

Centrez l’aiguille sur le bregma, puis insérez-la doucement dans l’hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes : Antérieur, postérieur moins deux, latéral médial plus moins un, dorsal ventral moins un. Ces coordonnées seront situées près du bord du domaine crânien. Attendez cinq minutes pour que le tissu se stabilise.

Injectez zéro virgule sept microlitres de solution AV à raison de 50 nanolitres par minute. Attendez 10 minutes pour que le virus soit complètement absorbé. Retirez délicatement l’aiguille.

Épongez avec de la mousse de gel en cas de saignement. Répétez l’opération avec le côté controlatéral. Posez le verre de couverture sec stérile sur le dessus de la dure-mère dans le cadre circulaire percé.

Tenez le verre de protection avec le préceps pour aplatir doucement la dure-mère et rapprocher les bords du verre de protection de la surface du crâne. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez la colle cyanoacrylate dense sur les bords du verre de couverture pour les fixer au crâne. Attendez que la colle sèche.

Placez une barre de fixation, un écrou anton ou un motif sur mesure dans la partie avant du crâne. Notez que la barre de fixation doit être placée dans une position qui permettra le positionnement horizontal de la fenêtre crânienne pendant la séance d’imagerie. Appliquez la colle sur les bords de la barre.

Attendez que la colle sèche. Notez que la barre de fixation doit être placée aussi loin que possible de la fenêtre. S’il est placé trop près de la fenêtre, la barre et la vis qui la relie au support sur mesure peuvent constituer un obstacle pour l’objectif pendant le processus d’imagerie.

Préparez l’acrylique dentaire et appliquez-le sur la surface du crâne autour du verre. Il est utile de former une forme de cratère autour de la fenêtre. Il va créer une cavité pour l’eau appliquée plus tard pour l’imagerie avec l’objectif d’eau.

Créez un capuchon avec l’acrylique dentaire, couvrant le reste de la zone opérationnelle, la barre de fixation des bords de la peau renforçant le cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire durcisse. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans la chambre de récupération.

Attendez que l’animal se remette de la chirurgie tout en observant les fonctions physiologiques. Appliquez l’anesthésie postopératoire cyroproferrine, 10 milligrammes par kilogramme, et le traitement antibiotique baytril, cinq milligrammes par kilogramme, pendant 48 heures. Démarrez le laser saphir ti, allumez le microscope.

Le système utilisé dans cette expérience est équipé d’un laser à deux photons, d’un système OPO et d’un PMT falsifié à l’arséniure de gallium. Mettez l’animal dans la chambre d’induction et induisez l’anesthésie. Retirez l’animal de la chambre d’induction et placez-le dans le masque d’anesthésie gazeuse sous le microscope.

Réduisez le débit d’oxygène à zéro point trois litres par minute et la concentration d’isoflurane à 1,52 %Fixez l’animal au cadre de microscope personnalisé avec une vis MT ou un autre système personnalisé. Nivelez la fenêtre crânienne. Notez qu’il est possible d’utiliser le système de fixation de la tête du fabricant du microscope, bien que le cadre personnalisé spécifique donne de meilleurs résultats, une meilleure stabilité de la tête, un positionnement constant en plusieurs séances au cours d’une expérience chronique.

À l’aide des réglages du microscope à grand champ, un objectif à faible grossissement, centrez la vue sur l’un des côtés du cortex rétrosplénial et concentrez-la sur la surface de la lamelle. Appliquez une gouttelette d’eau dans le puits acrylique en forme de cratère. Passez à un objectif d’immersion dans l’eau longue distance.

Déplacez l’objectif vers la fenêtre crânienne jusqu’à ce que le ménisque d’eau relie l’échantillon et l’objectif. Passez aux paramètres à deux photons et commencez à scanner l’échantillon de haut en bas en utilisant le zoom le plus bas. Le croisement de la matière de la dure-mère sera visible sous forme d’éblouissement d’un signal non spécifique élevé.

Ajustez les paramètres d’acquisition du microscope dans les deux canaux, GFP et mCherry, en fonction de l’intensité du signal des cellules fluorescentes afin de couvrir toute la plage dynamique. Après avoir trouvé un neurone approprié avec l’arbre dendritique séparé des autres cellules, effectuez un balayage initial en utilisant uniquement des filtres GFP réglés avec le zoom le plus bas et une distance Z de cinq microns. Obtenez une projection maximale de la pile de numérisation et imprimez-la pour les annotations en utilisant des couleurs inversées.

Réglez le zoom sur une valeur qui permettra d’imager les détails morphologiques souhaités. Imagez l’ensemble de l’arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry en utilisant la projection maximale comme guide. En utilisant ce protocole, il sera possible de surveiller de manière répétée les structures pré et post-synaptiques dans le cortex rétrospléniel.

Cette approche pourrait être utilisée dans le cadre d’une expérience chronique où les manipulations comportementales devraient être corrélées lorsque des changements dans la morphologie des dendrites, des épines synaptiques ou des neutrons pré-synaptiques. Les séances d’imagerie peuvent être effectuées à n’importe quelle fréquence, mais un intervalle de temps de 24 heures est préféré afin de permettre une bonne récupération de l’animal et de minimiser l’effet de l’anesthésie. Si elle est appliquée correctement, cette technique permet d’effectuer plusieurs séances d’imagerie sur une période de plusieurs mois.