Simultanée à deux photons

Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité d'éthique local de l'Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences. Cette vidéo montre une procédure de craniotomie permettant l'imagerie chronique des neurones du cortex rétrosplénial de la souris à l'aide de la microscopie à deux photons in vivo chez la lignée transgénique thi one-G of feet. Cette approche est combinée à l'injection d'un virus adéno-associé exprimant mCherry, AAV, dans l'hippocampe dorsal.

Combinées, ces techniques permettent une surveillance à long terme de la dépendance acquise et de la plasticité structurelle dans le cortex rétrosplénial. Dans cet article, nous proposons l'implantation d'une fenêtre crânienne au-dessus du cortex rétrosplénial comme région d'intérêt possible pour la microscopie in vivo à deux photons. Afin de visualiser les changements morphologiques dans les structures neuronales, nous utilisons des souris Thy1-GFP dans lesquelles environ 10 pour cent des neurones expriment la protéine fluorescente GFP.

Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un AAV, exprimant une protéine fluorescente mCherry sous un promoteur spécifique aux neurones, dans des structures cérébrales profondes, telles que l'hippocampe, afin de visualiser les projections de cette structure vers le cortex rétrosplénial. Stérilisez tous les outils, récipients en verre pour liquides et cotons-tiges dans l'autoclave. Vous portez des gants jetables.

Nettoyez la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez un champ opératoire stérile pour créer un espace stérile destiné à tout l'équipement stérilisé. Coupez la mousse en gel en petits morceaux et imbibez-les de sérum physiologique stérile.

Placer l'animal dans la chambre d'induction et régler le niveau d'isoflurane à 5 % et le débit d'oxygène à deux litres par minute. Cette procédure doit prendre environ trois minutes. Sortir l'animal de la chambre d'induction.

Utilisez des pressions légères sur la queue ou les orteils pour vous assurer que l'animal est complètement sédé. À l’aide de ciseaux précis, rasez les poils à l’arrière de la tête, entre les oreilles, jusqu’aux yeux. Placez l’animal dans le cadre stéréotaxique et stabilisez la tête à l’aide de barres auriculaires.

Régler les niveaux d'anesthésie sur 1,5 à 2 % d'isoflurane et 0,3 litre par minute d'oxygène. Appliquer la pommade ophtalmique. Injecter à l'animal par voie sous-cutanée du tolfédine, 4 milligrammes par kilogramme, du butomidore, 2 milligrammes par kilogramme, et du Baytril, 5 milligrammes par kilogramme, afin de prévenir respectivement l'inflammation, la douleur et l'infection.

Injecter l'animal par voie intramusculaire avec du dexaméthasone, zéro virgule deux milligramme par kilogramme, afin de prévenir un gonflement cérébral. Nettoyer la peau à l'aide de cotons-tiges stériles imbibés de bétadine, suivis d'éthanol à 70 %. Changer les gants et les pulvériser avec de l'éthanol à 70 %.

Soulevez la peau avec une pince et, à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, incisez horizontalement la peau à la base de la tête, puis obliquement jusqu’au point frontal situé entre les yeux. Retirez le lambeau de peau. Appliquez une pommade à la lidocaïne à l’aide d’un applicateur stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur.

Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour retirer le périoste. Séchez le crâne avec des cotons stériles. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez une colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser et éviter tout contact ultérieur avec le ciment dentaire.

Attendre que la colle sèche. Placer un verre de couverture stérile de trois millimètres sur le crâne, en avant de la suture lambdoïde. Centrer le lamelle aux coordonnées rétrospléniennes, antérieur-postérieur bregma moins deux virgule huit, médial-latéral bregma zéro.

Marquer les bords du lamelle en rayant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Remettre le lamelle dans le récipient stérile contenant de l'éthanol à 70 %. Utiliser une fraise dentaire à grande vitesse avec une fraise de petit diamètre pour tracer un cercle de trois millimètres de diamètre.

Nettoyer le site de perçage de la poussière osseuse à l’aide de compresses stériles imprégnées de solution saline. Utiliser la mousse en gel et les compresses pour arrêter les saignements occasionnels et nettoyer l’os. Entre les phases de perçage, vérifier l’épaisseur de l’os à l’aide de fines pinces en touchant délicatement le pourtour osseux et en évaluant sa mobilité.

Tenez compte du fait que l'os est plus épais au niveau des sutures. Arrêtez le perçage lorsque le cercle osseux est mobile et qu'une couche mince et uniforme d'os subsiste uniquement sur le pourtour. Nettoyez le champ opératoire de toute la poussière osseuse résiduelle à l’aide de compresses imbibées de sérum physiologique.

Déposer le sérum physiologique stérile sur la zone de perçage, en recouvrant le cercle percé. Soulever délicatement le cercle osseux à l’aide d’une pince fine, puis retirer l’os doucement mais fermement en le soulevant vers le haut. Veiller à ne pas tordre le cercle osseux lors de son retrait afin d’éviter tout dommage possible à la dure-mère.

Appliquez délicatement la mousse de gel imbibée de sérum physiologique stérile sur la dure-mère afin d'aider à arrêter le saignement. Attendez jusqu'à ce que tout saignement soit complètement interrompu. Retirez soigneusement la mousse de gel sans perturber le processus de coagulation.

Remarquez que la zone de suture est fortement vascularisée, de sorte que le saignement à ce niveau pourrait être abondant. Il est essentiel d'attendre un temps suffisant pour que le saignement cesse. Fixez la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connectez le contrôleur.

Insérez l'aiguille de calibre 35 dans la seringue de remplissage. Rincez la seringue 10 fois avec de l'éthanol pour la stériliser, puis 10 fois avec du sérum physiologique stérile pour éliminer toute trace d'éthanol. Éliminez les bulles d'air de la seringue.

Insérez la seringue dans la pompe. Remplissez une dose unique de préparation AV et conservez-la sur glace. Remplissez la seringue avec la solution virale.

Positionnez l'aiguille au niveau du bregma, puis insérez-la délicatement dans l'hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes : antérieur, postérieur moins deux, médial latéral plus ou moins un, dorsal ventral moins un. Ces coordonnées se situent près du bord du domaine crânien. Attendez cinq minutes pour permettre la stabilisation du tissu.

Injecter 0,7 µL de solution AV à un débit de 50 nL par minute. Attendre 10 minutes pour permettre une absorption complète du virus. Retirer délicatement l'aiguille.

Appliquez une compresse en mousse de gel en cas de saignement. Répétez l’opération du côté controlatéral. Placez le verre de couverture stérile et sec sur la dure-mère, à l’intérieur du cadre circulaire percé.

Tenez le verre de couverture avec la pince pour aplatir doucement la dure-mère et rapprocher les bords du verre de couverture de la surface du crâne. À l’aide d’une aiguille stérile, appliquez une colle cyanoacrylate dense sur les bords du verre de couverture afin de les fixer au crâne. Attendez que la colle sèche.

Placer une barre de fixation, un écrou Anton ou un modèle personnalisé sur la partie antérieure du crâne. Remarque : la barre de fixation doit être positionnée de manière à permettre un alignement horizontal de la fenêtre crânienne pendant la séance d'imagerie. Appliquer la colle sur les bords de la barre.

Attendez que la colle sèche. Remarque : la barre de fixation doit être placée aussi loin que possible de la fenêtre. Si elle est placée trop près de la fenêtre, la barre et la vis qui la relie au support sur mesure pourraient gêner l'objectif pendant le processus d'imagerie.

Préparez l'acrylique dentaire et appliquez-le sur la surface du crâne autour du verre. Il est utile de former une forme en forme de cratère autour de la fenêtre. Cela créera une cavité pour l'eau appliquée ultérieurement lors de l'imagerie avec l'objectif à immersion dans l'eau.

Créez un capot avec l'acrylique dentaire, recouvrant le reste des bords de la zone opératoire et la barre de fixation de la peau, en renforçant le pourtour du cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire durcisse. Retirez l'animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans la chambre de récupération.

Attendre que l'animal se remette de l'intervention chirurgicale tout en surveillant les fonctions physiologiques. Appliquer un traitement postopératoire d'anesthésie au cyroproferrin, 10 milligrammes par kilogramme, et un traitement antibiotique au baytril, 5 milligrammes par kilogramme, pendant 48 heures. Démarrer le laser Ti:saphir, puis mettre sous tension le microscope.

Le système utilisé dans cette expérience est équipé d'un laser à deux photons, d'un système OPO et de deux PMT au gallium arseniure falsifiés. Placez l'animal dans la chambre d'induction et induisez l'anesthésie. Retirez l'animal de la chambre d'induction et placez-le sous le masque d'anesthésie gazeuse sous le microscope.

Réduire le débit d'oxygène à 0,3 litre par minute et la concentration d'isoflurane à 1,52 %. Fixer l'animal au support microscopique sur mesure à l’aide d’une vis MT ou d’un autre système personnalisé. Niveler la fenêtre crânienne. Remarque : il est possible d’utiliser le système de fixation de la tête fourni par le fabricant du microscope, bien que le support sur mesure spécifique offre de meilleurs résultats, une stabilité accrue de la tête et un positionnement constant lors de plusieurs séances au cours d’une expérience chronique.

À l'aide des paramètres du microscope à grand champ, utilisez un objectif de faible grossissement pour centrer la vue sur l'un des côtés du cortex rétrosplénial et faites la mise au point sur la surface de la lamelle. Appliquez une goutte d'eau dans le puits en acrylique de forme creusée. Passez à un objectif à immersion dans l'eau à longue distance.

Déplacez l'objectif vers la fenêtre crânienne jusqu'à ce que le ménisque d'eau relie l'échantillon et l'objectif. Passez aux paramètres de bi-photons et commencez à balayer l'échantillon de haut en bas en utilisant le zoom le plus faible. Le franchissement de la dure-mère sera visible sous forme d'un reflet produit par un signal non spécifique élevé.

Ajustez les paramètres d'acquisition du microscope sur les deux canaux, GFP et mCherry, en fonction de l'intensité du signal provenant des cellules fluorescentes afin de couvrir toute la plage dynamique. Après avoir identifié un neurone approprié dont l'arborisation dendritique est séparée des autres cellules, effectuez un balayage initial en utilisant uniquement les filtres GFP avec le zoom le plus faible et une distance Z de cinq micromètres. Obtenez une projection maximale de la pile de balayage et imprimez-la pour y ajouter des annotations en utilisant des couleurs inversées.

Régler le zoom à une valeur permettant d’imager les détails morphologiques souhaités. Imager tout l’arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry en utilisant une projection maximale comme guide. Grâce à ce protocole, il sera possible de surveiller de façon répétée les structures pré- et post-synaptiques dans le cortex rétrosplénial.

Cette approche pourrait être utilisée dans le cadre d'une expérience chronique où des manipulations comportementales sont censées être corrélées à des changements dans la morphologie des dendrites, des épines synaptiques ou des neurones pré-synaptiques. Les séances d'imagerie peuvent être réalisées à n'importe quelle fréquence, mais un intervalle de 24 heures est préféré afin de permettre une récupération adéquate de l'animal et de minimiser l'effet de l'anesthésie. Si elle est correctement appliquée, cette technique permet d'effectuer plusieurs séances d'imagerie sur une période de plusieurs mois.