Name: PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de préparation à montage entier pour l'étude des cellules ganglionnaires de la rétine. Ce protocole permet le stockage à long terme des échantillons rétiniens sans immunomarquage immédiat.

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Ce travail a été financé par le projet d’ouverture des laboratoires clés du Hubei (subvention n ° 2021KFY055), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (subvention n ° 2020CFB240) et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (subvention n ° 2042020kf0065).

Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les souris C57BL / 6J utilisées ont été obtenues auprès du Centre des animaux de laboratoire de l’Université de Wuhan, et toutes les expériences connexes ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Wuhan. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance des souris.
1. Énucléation et fixation des yeux
<ol><li>Euthanasier les souris avec une asphyxie au dioxyde de carbone et énucléer doucement le globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler édentée.</li>
	<li>Rincer le globe oculaire une fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Percer le globe oculaire avec une aiguille de seringue au niveau de la cornée au microscope (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x) pour accélérer la fixation dans le globe oculaire et améliorer l’efficacité de fixation.</li>
	<li>Transférer dans une plaque de 24 puits contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA).</li>
	<li>Fixez le globe oculaire dans 4% PFA pendant 45 min, puis transférez-le sur 1x PBS pour éliminer l’excès de PFA (laver trois fois, 5 min / temps) immédiatement.</li>
</ol>2. Isolement et aplatissement de la rétine
<ol><li>Transférez le globe oculaire sur une lame de verre et placez-le sous un microscope à dissection (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x).</li>
	<li>Tenez la pince dans une main et utilisez-la pour serrer la marge de la cornée afin d’empêcher le mouvement du globe oculaire. Utilisez l’autre main pour tenir les ciseaux à dissection et couper autour de la cornée à environ 1 mm de profondeur à travers le limbe cornéoscléral. Retirez la lentille et le corps vitreux.</li>
	<li>Tenez le disque optique au centre et, à l’aide de ciseaux disséquants, coupez la rétine radialement le long des quatre quadrants, atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine.</li>
	<li>Serrez l’un des bords scléraux à l’aide d’une pince dentée. De l’autre main, tenez le bord de la sclérotique avec une pince non dentée et déplacez-vous de l’endroit où la sclérotique est fixée par la pince dentée vers la base de la sclérotique. Pelez soigneusement la rétine.</li>
	<li>Aspirez le PBS à l’aide d’une pipette (200 μL) pour rincer et mouiller la rétine, puis retirez tout excès de PBS avec un petit morceau de papier absorbant. Si nécessaire, aplatissez doucement la rétine avec une petite brosse à poils.</li>
	<li>Pipeter lentement le méthanol froid (prérefroidi dans un congélateur à −20°C) goutte à goutte sur la surface interne de la rétine (le volume de méthanol n’est pas fixé, tant que la rétine peut être complètement recouverte par le méthanol). La rétine devient blanche et développe une ténacité accrue.</li>
	<li>Aplatir doucement la rétine et éliminer les impuretés telles que les membranes pigmentaires résiduelles et le corps vitré avec de petites brosses à poils. Inverser la rétine à l’aide de petites brosses à poils et répéter le processus mentionné ci-dessus.</li>
	<li>Transférez la rétine traitée au méthanol dans un puits d’une plaque de 24 puits et maintenez-la trempée dans du méthanol.</li>
	<li>Conservez-le à -20 °C pendant 1 à 2 h pour une immunocoloration immédiate, ou laissez la rétine dans le méthanol et conservez-le à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Retirez le méthanol de la plaque à 24 puits et rincez la rétine avec 1x PBS.</li>
</ol>3. Coloration immunofluorescente des CGR
<ol><li>Transférer délicatement la rétine dans une plaque d’hémagglutination de 24 puits à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et bloquer dans 5 % de PBS-TX-BSA (5 g de poudre d’albumine sérique bovine dissoute dans 100 mL de 1x solution PBST; le PBST est formé en ajoutant 10 mL de Triton X-100 à 2 000 mL de 1 x PBS) à température ambiante pendant 4 h ou pendant une nuit à 4 °C. Gardez le côté ganglion vers le haut.</li>
	<li>Retirer le PBS-TX-BSA et incuber la rétine à 4 °C pendant 48-96 h, en ajoutant 100 μL de l’anticorps primaire sélectionné (anticorps anti-RBPMS du cobaye) en utilisant une dilution de 1:400.</li>
	<li>Retirez l’anticorps primaire et rincez la rétine trois fois (20 min chacune) avec 1x PBS, en agitant à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la rétine en agitant doucement pendant une nuit à 4 °C avec 100 μL de l’anticorps secondaire correspondant (voir le tableau des matériaux), cyanine Cy3 affiniPure âne anti-cobaye IgG (H+L), en utilisant une dilution de 1:400.</li>
	<li>Rincer la rétine avec 1x PBS trois fois (20 min chacune).</li>
	<li>Posez la rétine à plat sur la lame avec la couche de cellules ganglionnaires tournée vers le haut, déposez une quantité appropriée d’agent de trempe antifluorescence autour de la rétine avec une pipette et couvrez la lame avec une lamelle de couverture (veillez à ne pas avoir de bulles). REMARQUE: Pour déterminer la quantité appropriée d’anti-fluorescence, assurez-vous qu’il couvre toute la rétine. Après cela, couvrez la lame sans permettre à la rétine de flotter et de bouger facilement.</li>
	<li>Scellez la lame tout autour avec un agent d’étanchéité pour l’empêcher de bouger. Conservez les échantillons à −20°C et à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Imagez la rétine à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence.</li>
</ol>

Isolement de la rétine de souris et traitement au méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires de la rétine

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
<li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+damage%3A+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li>
<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
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<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li>
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<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont connaissance d’aucune affiliation, adhésion, financement ou participation financière qui pourrait affecter l’objectivité de cette étude.

La fixation est une étape essentielle pour préserver la rétine, ce qui peut avoir un impact sur les investigations ultérieures du RGC basées sur la morphologie. Une fixation réussie capture rapidement la structure et l’état des rétines au moment de les exposer au milieu de fixation, ce qui est essentiel pour une analyse plus approfondie. Bien que le formaldéhyde ait été considéré comme l’un des agents de fixation les plus courants pour la fixation et la conservation des tissus et des cellules, le formaldéhyde seul ne fon...

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont les seuls neurones de projection dans la rétine, et elles intègrent et transmettent des informations visuelles extérieures au cerveau1. De nombreuses maladies neurodégénératives telles que le glaucome et la neuropathie optique traumatique sont caractérisées par des dommages irréversibles et la perte deCGR2,3. L’analyse des changements morphologiques et quantitatifs des CGR est une étape cruciale pour déterminer comment les maladies neurodégénératives se développent et progressent 4,5.
Le test d’immunofluorescence indirecte est une méthode largement acceptée pour surveiller la distribution des protéines et le comptage cellulaire. En laboratoire, l’immunomarquage rétinien à montage entier est couramment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions physiologiques et pathologiques de la rétine6. Les marqueurs les plus couramment utilisés pour la quantification du RGC dans l’ensemble de la rétine comprennent Brn3a, protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), et ainsi de suite 7,8. La caractérisation de la quantité et de la distribution des CGR nécessite une immunocoloration rétinienne de haute qualité à montage entier. Généralement, dans les protocoles d’immunomarquage, la rétine est immergée dans des fixateurs chimiques avant d’être incubée dans des anticorps. Les fixateurs idéaux ne doivent pas modifier la forme des cellules, l’accessibilité ou l’affinité des épitopes pour les anticorps, ni les dimensions linéaires du tissu 9,10.
En raison de la structure complexe de la rétine, des problèmes tels que la fragilité et le repliement de la rétine, ainsi que certaines difficultés courantes, notamment le rétrécissement des cellules et des noyaux peu clairs, sont susceptibles de se produire lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier, ce qui a un impact négatif sur la recherche expérimentale. En outre, toutes les rétines ne sont pas immunocolorées immédiatement, en particulier lorsqu’il s’agit des rétines de souris transgéniques à des prix élevés et d’origine précieuse, ce qui nécessite la préservation des échantillons rétiniens supplémentaires pour une utilisation ultérieure.
La solution fixatrice appropriée peut fixer rapidement le tissu, éviter l’autolyse tissulaire, préserver la morphologie et la structure normales des cellules tissulaires et conserver l’antigénicité des protéines et autres substances10. À l’heure actuelle, la fixation à base de formaldéhyde a été largement utilisée dans divers tissus, y compris les rétines séparées, les œillets hémisectés et les globes oculaires entiers10. Le rétrécissement tissulaire et l’altération morphologique des cellules sont les deux défis critiques rencontrés après l’immersion dans le formaldéhyde11. De plus, des formulations de fixation modifiées voient de plus en plus le jour pour maximiser la rétention des propriétés originales de la rétine et des cellules cibles 9,10. Différents traitements de fixation rétinienne peuvent affecter différemment la structure rétinienne, l’immunogénicité des protéines, l’excitation par fluorescence et le cycle de tremped’atténuation 12,13. Les rétines fixées avec la solution de Davidson sont plus morphologiquement intactes que celles fixées avec du formol, mais la solution de Davidson est moins compatible avec certains anticorps, tels que la molécule d’adaptateur de liaison au calcium ionisée par marqueur microglial 112. Compte tenu de la nature fragile des rétines, les chercheurs se demanderaient naturellement si l’intégrité rétinienne, ainsi que les propriétés et la morphologie des cellules cibles, changeront après un stockage à long terme. Cependant, les effets possibles de la solution de fixation sur la morphologie des cellules rétiniennes et RGC après stockage pendant plusieurs mois ont rarement été rapportés. L’optimisation de la fixation rétinienne est essentielle pour l’évaluation et la préservation des CGR.
Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour la coloration rétinienne murine à montage entier. Notre méthode met l’accent sur la préparation et le stockage appropriés des rétines pour l’investigation du CGR, en tenant compte de la nécessité de stockage à long terme du tissu rétinien ainsi que des aspects spécifiques de la formation ou de la dégradation des fluorophores.

<table><tbody><tr><td>Grappe de culture cellulaire à 24 puits</td><td>Costar</td><td></td><td>Fixation du globe oculaire Plaque</td></tr><tr><td>d’hémagglutination à 24 puits</td><td>Labedit Company</td><td></td><td>Incubation Anticorps</td></tr><tr><td>Lames de microscope à adhésion</td><td>Citotest</td><td></td><td>Ou similaire</td></tr><tr><td>Montage d’extinction anti-fluorescent</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Ralentissement de l’extinction de la fluorescence</td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>Réactif bloquant</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>Apply Objectif 40x</td></tr><tr><td>Ciseaux incurvés</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>RWD Life science Co.,LTD&nbsp ;</td><td>77001S</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge ; 99.5 %</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>SecheVite</td><td></td><td>Agent d’étanchéité</td></tr><tr><td>Aiguilles&nbsp ;</td><td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td><td></td><td>Accélérer la fixation</td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Fixation du globe oculaire</td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Rincer le globe oculaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps primaire : protéine anti-liaison à l’ARN de cobaye avec épissage multiple (RBPMS)</td><td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. #1832-RBPMS Pour l’immunofluorescence</td><td>. Utilisé à 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : Cy3 affiniPure donkey anti-cobaye IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:400</td></tr><tr><td>Ciseaux droits</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Outils de dissection</td></tr></tbody></table>

prÉparation À montage entier À base de mÉthanol pour l’Étude des cellules ganglionnaires de la rÉtine

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui sont les neurones de projection de la rétine, propagent des informations visuelles externes au cerveau. Les changements pathologiques dans les RGC ont une relation étroite avec de nombreuses maladies dégénératives de la rétine. L’immunomarquage rétinien à montage entier est fréquemment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions développementales et pathologiques de la rétine. Dans certaines circonstances, certains échantillons précieux de rétine, tels que ceux provenant de souris transgéniques, peuvent devoir être conservés pendant une longue période sans affecter la morphologie ou le nombre de CGR. Pour des résultats expérimentaux crédibles et reproductibles, l’utilisation d’un milieu de conservation efficace est essentielle. Ici, nous décrivons l’effet du méthanol en tant que milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme. En bref, pendant le processus d’isolement, du méthanol froid (-20 °C) est pipeté à la surface de la rétine pour aider à fixer les tissus et faciliter leur perméabilité, puis les rétines peuvent être stockées dans du méthanol froid (-20 °C) avant d’être immunocolorées. Ce protocole décrit le flux de travail d’isolement de la rétine et le protocole de stockage des échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour l’étude des CGR.

Après la dissection, la rétine devrait ressembler à un trèfle plat à quatre feuilles. Dans cette étude, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, la rétine est devenue blanche après l’ajout de méthanol (Figure 1). Pendant ce temps, la rétine est passée de molle à souple et plate. Ensuite, les RGC ont été étiquetés avec anti-RBPMS8. Quatre champs d’image ont été pris dans la rétine à monture entière (n = 3) à l’aide d’un microscope confocal (oculaire : 10x ; objectif...

Le méthanol peut être utilisé comme milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme, ce qui est utile pour l’investigation des cellules ganglionnaires de la rétine.

PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

La recherche vise à fournir un flux de travail modifié d’isolation de la rétine et un protocole de stockage d’échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour étudier les CGR. Les rétines sont fragiles et repliables, ce qui limite la recherche expérimentale lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier. De plus, toutes les rétines ne nécessitent pas d’immunocoloration immédiate.Parfois, des échantillons de rétine supplémentaires doivent être conservés pour une utilisation ultérieure. Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple de coloration de la rétine à montage entier qui met l’accent sur la préparation appropriée et la nécessité du stockage à long terme des rétines pour l’investigation RGC. Nous continuerons à travailler sur la recherche fondamentale sur les neuropathies optiques dégénératives.En outre, le mécanisme moléculaire des lésions du nerf optique et de la régénération accidentelle et les cibles cliniques potentielles pour le diagnostic et le traitement des maladies neurodégénératives seront explorés.

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Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

Source : Laboissonnière, et. al. Séquençage de l’ARN unicellulaire de sous-ensembles définis de cellules ganglionnaires rétiniennes. J. Vis. exp. (2017).  Cette vidéo présente une technique de traçage par fluorescence pour identifier les sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans une rétine de souris transgénique. Le processus consiste à fixer la rétine isolée dans une chambre d’enregistrement, à maintenir la viabilité cellulaire grâce à une perfusion oxygénée et à cibler les...

Identification de sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes de souris par traçage fluorescent

Cet article de la vidéo illustre la mise en place, les procédures de patcher les corps cellulaires et la façon de mettre en œuvre les enregistrements de serrage dynamiques à partir de cellules ganglionnaires dans l'ensemble du montage souris rétines. Cette technique permet l'étude de la contribution précise des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs, et leur importance relative et le calendrier de dopage neuronale.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans...

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Ce protocole décrit la procédure d’isolement de la rétine de souris et d’immunomarquage pour marquer toutes les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Le processus est suivi d’une imagerie et d’un comptage automatique des CGR à l’aide d’un logiciel basé sur l’IA, offrant une méthode simple, rapide et précise pour quantifier les CGR dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Ici, nous décrivons l’utilisation d’une méthode de marquage à la phosphatase alcaline (AP) génétiquement dirigée pour étudier les caractéristiques anatomiques et les phénotypes des rétines de souris sous excitotoxicité induite par NMDA. En conjonction avec plusieurs lignées de rapporteurs spécifiques aux sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), nous découvrons de nouveaux phénotypes chez les CGR mourants tout au long du processus dégénératif.

Examen des caractéristiques anatomiques des cellules ganglionnaires rétiniennes sous excitotoxicité induite par l’acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA)

Découvrez une méthode de préparation à montage entier pour l'étude des cellules ganglionnaires de la rétine. Ce protocole permet le stockage à long terme des échantillons rétiniens sans immunomarquage immédiat.

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