Name: Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez la modélisation de la barrière hémato-encéphalique avec la plateforme MicroSiM utilisant des cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode permet d'étudier l'impact de la sepsis sur le cerveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. et L.W. ont été financés par la subvention R33 HL154249 du NIH. J.L.M. a été financé par R44 GM137651. M.M. a été financé par le prix du programme Schmidt de l’Institut Del Monte pour les neurosciences de l’Université de Rochester. M.T. a été financé par RF1 AG079138. K.C. a été financé par l’International Foundation for Ethical Research.

Analyse de modèles de barrière hémato-encéphalique par coloration par immunofluorescence

<ol><li>Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+concept+of+the+blood+brain+barrier+%28BBB%29%3A+from+a+single+static+barrier+to+a+heterogeneous+and+dynamic+relay+center%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).</li>
<li>Nation, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+is+an+early+biomarker+of+human+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction.</a> Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).</li>
<li>Ferrari, C. C., Tarelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and systemic inflammation.</a> Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).</li>
<li>Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barrier-on-chip%3A+a+technology+for+reproducible+practice+in+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
<li>Ortiz, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+blood-brain+barrier+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis.</a> Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).</li>
<li>Orhun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+inflammatory+markers+and+cognitive+outcome+in+patients+with+acute+brain+dysfunction+due+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis.</a> Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+and+cognitive+impairment%3A+neuroinvasive+and+blood-brain+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).</li>
<li>Hughes, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+injury+as+risk+factors+for+delirium+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients.</a> Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).</li>
<li>Saraiva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+brain+drug+delivery%3A+Overcoming+blood-brain+barrier+to+treat+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases.</a> Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).</li>
<li>Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier+and+improvement+of+brain+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).</li>
<li>Abbott, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).</li>
<li>Siflinger-Birnboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sieving+characteristics+of+the+cultured+endothelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer.</a> Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).</li>
<li>Bischoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+assessing+microvascular+endothelial+barrier+function%3A+impedance-based+devices+versus+the+classic+macromolecular+tracer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay.</a> Scientific Reports. 6, 23671(2016).</li>
<li>van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microfluidic+models+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+permeability+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+depend+on+epithelial+or+endothelial+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features.</a> FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).</li>
<li>Vigh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+electrical+resistance+measurement+across+the+blood-brain+barrier%3A+a+critical+review+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods.</a> Micromachines. 12 (6), 685(2021).</li>
<li>Lea, T., et al. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).</li>
<li>Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+are+affected+by+junctional+length+in+immature+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers.</a> Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Mossu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicon+nanomembrane+platform+for+the+visualization+of+immune+cell+trafficking+across+the+human+blood-brain+barrier+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).</li>
<li>Castro Dias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+tricellular+junctions+as+novel+sites+for+T-cell+diapedesis+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Khire, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+mimetics+for+the+study+of+lukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apicobasal+polarity+coordinates+distinct+responses+to+luminally+versus+abluminally+delivered+TNF-alpha+in+a+microvascular+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).</li>
<li>DesOrmeaux, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+silicon+nitride+membranes+fabricated+from+porous+nanocrystalline+silicon+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates.</a> Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).</li>
<li>Hill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+nanoporous+silicon+nitride+membranes+for+high+toxin+clearance+and+small+format+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+dual-scale+nano-+and+microporous+membranes+for+vascular+transmigration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models.</a> Small. 15 (6), e1804111(2019).</li>
<li>Gillmer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+failure+of+ultrathin+porous+membranes+in+bulge+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests.</a> Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).</li>
<li>Ishimatsu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+permeability+of+ultrathin+nanopore+silicon+membrane+as+studied+using+nanofabricated+micropipet+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes.</a> Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-permeability+relationship+of+ultrathin+nanoporous+silicon+membrane%3A+a+comparison+with+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope.</a> Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).</li>
<li>Snyder, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+molecular+separations+by+diffusion+through+ultrathin+nanoporous+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes.</a> Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).</li>
<li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+%C2%B5SiM%3A+a+mass+produced%2C+rapidly+assembled%2C+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+microSiM+reconfigured%3A+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).</li>
<li>Su, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+chip+with+integrated+digital+immunosensors%3A+In+situ+brain+endothelial+barrier+cytokine+secretion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring.</a> Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+pericyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest.</a> Current Protocols. 1 (1), e21(2021).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li>
<li>Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+blood-brain+barrier+%28not%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What is the blood-brain barrier (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).</li>
</ol>

J.L.M. est co-fondateur de SiMPore et détient une participation dans la société. SiMPore commercialise des technologies ultraminces à base de silicium, y compris les membranes utilisées dans cette étude.

Bien que les puces de membrane aient été conçues pour la stabilité, elles peuvent se fissurer ou se casser si elles sont mal manipulées lors de l’assemblage. Ainsi, il est essentiel de saisir la puce dans les encoches de la pince à puce et de la placer doucement dans le luminaire. Lors de la manipulation des appareils en général, des précautions supplémentaires doivent être prises pour ne pas heurter ou faire tomber les appareils. Lors du collage de la puce de membrane au luminaire A1, le coque doit être posé à plat et centré sur le pilier du luminaire A1 pour éviter la fissuration de la membrane lors du collage au composant 1. De plus, tout contact avec les couches de PSA exposées doit être évité après avoir retiré les masques de protection. Lors de la manipulation du composant 2 après le retrait des masques de protection, il est conseillé de le tenir le long du bord du composant et d’utiliser une pince à épiler pour saisir le coin triangulaire qui est exempt de PSA.
Bien que des protocoles de culture cellulaire aient été décrits pour d’éventuels modèles de BHE, le modèle de co-culture BMEC/péricyte de la BHE décrit ici peut être suffisant ou insuffisant en fonction du contexte physiologique et des questions d’intérêt. Par exemple, le trafic des cellules immunitaires se produit en grande partie dans les veinules postcapillaires du cerveau41,42. Dans ces régions, un espace périvasculaire sépare la barrière BMEC/péricyte des limites gliales établies par les astrocytes. Ainsi, dans les veinules postcapillaires, l’unité neurovasculaire (NVU) comprend deux barrières physiquement séparées en série, et les extrémités astrocytaires ne sont pas directement en contact avec la barrière sanguine BMEC/péricyte, qui est bien représentée par le modèle actuel. Si l’objectif est un modèle NVU qui tient compte de l’impact des facteurs sécrétés par les astrocytes sur la barrière sanguine, un compartiment astrocytaire pourrait être ajouté au dispositif qui permet l’échange de facteurs solubles à travers l’espace périvasculaire. Cet exemple a été illustré précédemment34 et pourrait être étendu pour inclure d’autres cellules telles que la microglie et les neurones dans un compartiment 3D « cerveau ». L’architecture modulaire de la plate-forme permet d’utiliser des stratégies d’assemblage simples pour réaliser ces reconfigurations afin que la plate-forme soit aussi simple ou complexe que nécessaire pour répondre aux hypothèses à portée de main. Chaque installation de culture cellulaire ; Cependant, elle doit être optimisée pour les nouvelles lignées cellulaires et les multi-cultures. Par exemple, en raison des propriétés des membranes en nitrure de silicium, il peut être nécessaire d’ajuster les solutions de revêtement par rapport aux plaques de culture tissulaire. L’inclusion de fibronectine aide généralement à l’attachement cellulaire et à la survie. De plus, les utilisateurs pourraient cultiver des cellules endothéliales et des péricytes dans des directions opposées. Dans ce cas, il peut être nécessaire de modifier, par exemple, la façon dont les mesures de perméabilité sont effectuées et interprétées. Cependant, fournir des étapes pour ce type de culture dépasse le cadre de ce document.
Un autre défi que l’on peut rencontrer lors de la culture cellulaire est l’évaporation rapide des milieux, car les dispositifs peuvent être plus sensibles aux altérations de l’environnement que les plaques et flacons de culture tissulaire standard. Si une évaporation excessive est observée ou si la croissance cellulaire est ralentie, tous les paramètres critiques de l’incubateur doivent être mesurés pour garantir des réglages précis. Plus d’eau peut être ajoutée au capuchon tissulaire ou à la petite boîte de Pétri placée à l’intérieur de la chambre de culture cellulaire, ou les milieux doivent être remplacés plus fréquemment. De plus, des bulles peuvent pénétrer dans le canal inférieur et se coincer dans la tranchée pour les dispositifs de tranchée. Bien qu’ils puissent être retirés, il est plus facile d’éviter d’ajouter des bulles en premier lieu. Pour ce faire, il est important de vérifier qu’il n’y a pas de bulles dans l’embout de pipette ou d’air à l’extrémité de l’embout de pipette avant de pipeter le milieu dans la chambre inférieure. De plus, l’évaporation du média dans le canal peut entraîner un espace entre la surface du support et le dessus de l’orifice. Un petit volume de média peut être pipeté dans un port jusqu’à ce que le support atteigne la surface du port opposé, après quoi le support peut être échangé dans ce port opposé. Bien que les milieux hECSR et E6 + 10 % FBS ne doivent pas être réchauffés au bain-marie, d’autres milieux peuvent être préchauffés pour réduire la formation de bulles. Si une bulle pénètre dans la chambre inférieure, elle peut être éliminée en pipetant rapidement 100 μL à travers le canal. Cependant, cette méthode peut entraîner une contamination entre les chambres ou un déversement de fluide sur la surface de l’appareil. Il peut également perturber les couches cellulaires. Alternativement, le média peut être d’abord retiré du canal, puis réintroduit avec un volume de 50 μL. Cependant, le fait de retirer le média en premier peut entraîner la formation de bulles dans le canal. Si une bulle n’est pas directement sous la zone de la membrane, elle peut être laissée dans le canal sans effet sur la culture cellulaire.
L’attachement et la croissance des péricytes, comme le montre la figure 2, peuvent être difficiles. L’utilisation d’une densité de semis optimisée est essentielle pour la formation d’une couche avec un rapport péricyte/cellule endothéliale physiologiquement pertinent. De plus, comme les péricytes sont sensibles au cisaillement, tous les échanges de milieux dans le canal doivent se faire très lentement pour protéger les cellules. Pour la culture BPLC, une meilleure fixation peut être obtenue en enduisant la chambre inférieure de 800 μg/mL de collagène de type IV ou de 100 μg/mL de fibronectine.
L’immunocytochimie dans les dispositifs décrits ici permet une analyse qualitative de la santé et de la fonction des cellules. Les méthodes de coloration dans des plaques de culture tissulaire ou d’autres plates-formes doivent être directement transposables dans la plate-forme. Pour la culture cellulaire dans la chambre supérieure uniquement, après fixation, le PBS peut être ajouté dans la chambre inférieure et laissé pour les étapes restantes, le blocage et la coloration étant effectués uniquement dans la chambre supérieure. Cela minimise les risques de rupture des membranes ou de formation de bulles dans la chambre inférieure. Pour la coloration en co-culture, nous recommandons d’utiliser les deux chambres à toutes les étapes. Il est important de noter que la viscosité du fixateur et du PBS est différente de celle du milieu. Ainsi, il peut être plus facile d’ajouter des bulles dans la chambre inférieure, et des précautions supplémentaires doivent être prises pour vérifier la présence d’air dans les pointes de pipette à l’extrémité de la pointe avant de pipeter dans la chambre inférieure.
Le protocole décrit pour le test de perméabilité aux petites molécules permet une évaluation fonctionnelle et quantitative de la fonction barrière des cellules endothéliales cultivées dans le dispositif μSiM. L’un des problèmes qui peuvent être rencontrés au cours de cet essai est l’aspiration de bulles d’air dans la pipette lors du prélèvement de l’échantillon à partir du canal inférieur à l’étape de protocole 4.1.7.4. Pour éviter ce problème, il est important de s’assurer que l’embout est scellé dans l’orifice avant de commencer le prélèvement de l’échantillon et que l’échantillon ne doit pas être prélevé trop rapidement. Si cela ne résout pas le problème, la taille des embouts utilisés peut être trop petite ou trop grande pour tenir dans les ports ; utilisez les conseils énumérés dans le tableau des matériaux. Si des valeurs de perméabilité élevées inattendues sont mesurées malgré une monocouche confluente d’apparence saine, l’intégrité de la monocouche doit être vérifiée pour détecter toute perturbation lors du prélèvement de l’échantillon. Nous recommandons de toujours vérifier la monocouche au microscope immédiatement après le prélèvement de l’échantillon. Si la monocouche semble encore intacte et saine, l’échantillon peut être fixé et les marqueurs biologiques de la fonction barrière peuvent être évalués, par exemple par immunomarquage des protéines jonctionnelles. À l’inverse, si des valeurs de perméabilité étonnamment faibles sont mesurées, il est important de s’assurer que 50 μL de milieu sont prélevés dans le canal inférieur sans bulles d’air. Si le milieu sort de l’orifice d’échantillonnage dès que l’embout du réservoir est placé, ce milieu doit être recueilli avant d’insérer la pipette dans l’orifice d’échantillonnage, car la majeure partie de la petite molécule fluorescente sera présente dans le volume initial de 10 μL prélevé dans le canal inférieur. Dessiner des cercles autour des orifices à l’aide d’un stylo hydrophobe ou placer un ruban hydrophobe avec un trou autour de l’orifice empêche tout média pompé passivement de se propager. Si des bulles sont prélevées pendant l’échantillonnage ou si l’échantillon complet de 50 μL n’est pas retiré, l’échantillon ne doit pas être utilisé. Alternativement, le volume exact peut être déterminé et utilisé dans le calcul de perméabilité ; cependant, cela ne doit être fait que si le volume retiré est de ≥40 μL, ce qui correspond à ~98-99% de récupération du colorant34.

Les tissus vivants sont compartimentés par des cellules spécialisées qui créent et maintiennent des barrières et régulent les cellules et les molécules qui sont transportées d’un compartiment à l’autre. Une mauvaise régulation des fonctions barrières peut être à l’origine de maladies aiguës et de maladies chroniques. La barrière hémato-encéphalique (BHE) est la barrière tissulaire la plus restrictive du corps humain1. Le dysfonctionnement de la BHE est à l’origine d’un large éventail de maladies du système nerveux central (SNC), notamment la maladie d’Alzheimer2, la maladie de Parkinson 3,4 et la sclérose en plaques 5,6. Les lésions de la BHE sont également liées à des troubles cognitifs à long terme résultant de troubles aigus, tels que la septicémie7, la COVID-198 et le délire postopératoire9. La mise au point de médicaments ayant le potentiel de traiter des troubles cérébraux a été extrêmement difficile en raison du défi que représente la violation intentionnelle de la BHE pour délivrer des molécules bioactives à des cibles dans le cerveau10. Pour ces raisons, les méthodes d’étude de la fonction de la BHE in vitro sont d’une importance capitale pour la compréhension et le traitement des maladies du SNC.
Les méthodes de base pour mesurer la fonction barrière in vitro impliquent l’établissement d’une monocouche ou d’une co-culture sur une membrane semi-perméable et la mesure de la résistance conférée par les cellules à la diffusion de petites molécules ou à de petits courants électriques11,12,13,14. Alors que l’émergence des systèmes microphysiologiques (MPS) a produit une abondance de choix pour la modélisation de la BHE en 3D15,16, la diversité des géométries des systèmes rend difficile la comparaison des mesures de perméabilité entre les MPS ou avec les valeurs établies dans la littérature. L’établissement de valeurs de référence fiables est particulièrement important dans la recherche sur la BHE où, en raison de la régulation étendue de la barrière par les cellules endothéliales vasculaires du cerveau, les valeurs de perméabilité in vitro sont très scrutées12,17,18. Pour ces raisons, les mesures de perméabilité à travers les monocouches établies sur des membranes 2D resteront un élément de base des études de la BHE pour les années à venir. Cela est vrai pour d’autres barrières tissulaires, y compris les barrières épithéliales, où les valeurs absolues de la perméabilité de base sont utilisées pour valider et comparer les modèles in vitro 19,20,21.
Dans le but d’établir un nouvel outil précieux pour la communauté de recherche BBB, nous avons introduit22 et avancé 23,24,25,26 le micro-dispositifdoté d’une plate-forme de membrane de silicon(μSiM) pour une utilisation dans la modélisation des tissus barrières au cours des 5 dernières années. La caractéristique habilitante de la plate-forme est une membrane ultramince (<100 nm d’épaisseur) avec des centaines de millions de nanopores 27,28 ou un mélange de nanopores et de micropores29. Les puces membranaires autoportantes sont produites sur une « puce » de silicium de 300 μm qui stabilise les structures ultraminces30 et leur permet d’être manipulées par une pince à épiler pour l’assemblage du dispositif. En raison de leur nature ultramince, les membranes ont une perméabilité supérieure de deux ordres de grandeur à celle des membranes conventionnelles gravées sur traces utilisées dans les dispositifs commerciaux de culture membranaire31,32. En pratique, cela signifie que l’entrave de la membrane à la diffusion de molécules plus petites que les nanopores (<60 nm) est négligeable33. Ainsi, pour les barrières cellulaires, seules les cellules et les matrices qu’elles déposent détermineront la vitesse de transport des petites molécules des compartiments apical vers les compartiments basaux séparés par la membrane34. La conception de l’appareil et la nature ultra-mince des membranes offrent également de nombreux avantages pour la microscopie optique. Il s’agit notamment 1) de la possibilité de suivre des cultures vivantes à l’aide d’un contraste de phase ou d’une imagerie en champ clair, 2) de la possibilité de colorer et d’imager par fluorescence in situ sans avoir besoin d’extraire et de transférer la membrane sur un verre de protection, et 3) le fait que les membranes sont plus minces que les « tranches » confocales, de sorte que les co-cultures directes ont un espacement plus naturel entre les types de cellules que ce qui peut être obtenu avec des membranes gravées à la trace de 6 à 10 μm d’épaisseur.
Plus récemment, nous avons fait évoluer la plate-forme vers un format modulaire pour faciliter l’assemblage rapide34 et la personnalisation35,36. Nous avons tiré parti du format modulaire pour distribuer les composants des dispositifs entre nos laboratoires de bio-ingénierie et les laboratoires de barrière cérébrale collaborateurs. Nous avons ensuite développé conjointement des protocoles pour l’assemblage de dispositifs, la monoculture et la co-culture, la coloration par immunofluorescence et la perméabilité des petites molécules et montré que ces méthodes étaient reproductibles entre laboratoires. À l’aide de ces protocoles, nous avons également montré que la plateforme modulaire prend en charge une BHE validée développée à l’aide de la méthode de culture endothéliale étendue (EECM) pour créer des cellules endothéliales de type microvasculaire cérébral (BMEC) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs)37. L’objectif du présent rapport est d’examiner ces méthodes plus en détail et, à l’aide de la vidéo qui l’accompagne, de faciliter une adoption plus large de la plateforme dans la communauté BBB.

<table><tbody>Anticorps polyclonaux <tr><td><></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG de souris Claudin-5, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>IgG de chèvre &alpha ;-souris Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG de chèvre &alpha ;-lapin Alexa Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, souris IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp ; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Anticorps IgG de souris occludine, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta ;, anticorps IgG de lapin, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadhérine souris IgG2B Clone # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Anticorps IgG de lapin, polyclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td><fort>Produits chimiques, peptides et protéines recombinantes</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % Méthanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>supplément B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagène IV du placenta humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Collagène, solution de type I de la queue de rat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Muscle de croissance des cellules endothéliales-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sérum de pointe</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine du plasma bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine protéine humaine, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH sel de dilithium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>PBS sans calcium, magnésium</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Utiliser le kit complet (comprend les suppléments)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>Eau distillée sans DNase/RNase UltraPure</td><td>Invitrogen&trade ;</td><td>10977015</td><td>Peut être substitué par des produits similaires</td></tr><tr><td>Modèles expérimentaux : Lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrière hémato-encéphalique hCMEC/D3 lignée cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Péricytes vasculaires du cerveau humain</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 cellules souches pluripotentes induites humaines</td><td>WiCell</td><td>RRID :CVCL_C437</td><td></td></tr> Plat de culture cellulaire <tr><td>Verrerie et plastique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm traité TC avec grille de 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Clamps</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire Corning (6 puits)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques plates non contraignantes 96 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Support de lame de microscope</td><td>&nbsp ; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Dimensions compatibles avec les porte-lames de micropscope</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>Les bouchons de tubes peuvent être remplis d’eau pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>P20-200 Pointes de pipette</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Les autres marques peuvent ne pas être aussi étanches aux ports</td></tr><tr><td>Les filtres Transwell (12 puits, 12 mm, 0,4 & taille des pores, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif 10X (pour Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Air ; WD : 4 mm ; Objectif NA 0.45</td></tr><tr><td>10X (pour Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Air ; WD : 6,2 mm ; Objectif NA 0.25</td></tr><tr><td>40X (LWD) (Pour Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Immersion dans l’eau ; WD : 590-610 mm ; NA 1.15</td></tr><tr><td>Andor Spinning Disc Microscope confocal</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 Microscope à contraste de phase</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP</td><td>Pen Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>pointe de 2 mm est recommandée</td></tr><tr><td>Kit de montage avec fixations</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Y compris les fixations A1, A2, B1 et B2</td></tr><tr><td>Adaptateur d’appareil photo pour microscopes</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&phi ; 23.2 - et phi ; Adaptateur 30 pour Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 Appareil photo reflex numérique</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Peut être remplacé par des produits similaires</td></tr><tr><td>Crépine à cellules, 40 & micro ; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Composant 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Composant 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Puces à membrane</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>D’autres formats de copeaux sont disponibles</td></tr><tr><td>Pince de manutention SMD double angle</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>"Pince à copeaux"</td></tr><tr><td>Inox pince à épiler GG de type acier</td><td>de précision Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>"Pince à épiler droite"</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Pour le traitement d’images</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Instructions pour la version 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Instructions pour la version 2.0</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Pour le traitement d’images. Instructions pour la version 9.9.0</td></tr></tbody></table>

utilisation de la plateforme tissulaire barrière microsim (μsim) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

Le microSiM (μSiM) est une plateforme de culture membranaire pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Contrairement aux plates-formes membranaires conventionnelles, le μSiM offre aux expérimentateurs de nouvelles capacités, notamment l’imagerie de cellules vivantes, la signalisation paracrine sans entrave entre les chambres « sanguines » et « cérébrales », et la possibilité d’imager directement l’immunofluorescence sans avoir besoin d’extraction/remontage des membranes. Nous démontrons ici l’utilisation de base de la plateforme pour établir des modèles de monoculture (cellules endothéliales) et de co-culture (cellules endothéliales et péricytes) de la BHE à l’aide de membranes nanoporeuses ultraminces en nitrure de silicium. Nous démontrons la compatibilité avec les cultures de cellules primaires et les cultures de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous fournissons des méthodes d’analyse qualitative des modèles de BHE par coloration par immunofluorescence et démontrons l’utilisation du μSiM pour l’évaluation quantitative de la fonction barrière dans un test de perméabilité aux petites molécules. Les méthodes fournies devraient permettre aux utilisateurs d’établir leurs modèles de barrière sur la plate-forme, faisant ainsi progresser l’utilisation de la technologie des puces tissulaires pour l’étude des tissus humains.

L’assemblage d’un dispositif de tranchée est illustré à la figure 1. Les fixations guident l’assemblage des composants et de la puce de membrane. Le composant 1 est principalement composé d’acrylique avec une surface PSA pour le collage à la puce et une ouverture vers la chambre inférieure et des orifices pour l’accès de la pipette à la chambre inférieure. Le composant 2 est la couche de canal et contient un « triangle » non adhésif et sans PSA en haut à droite pour la préhension. Les dispositifs de tranchée fournissent une zone de croissance de la culture cellulaire plate dans la chambre supérieure, tandis que les dispositifs de tranchée ont une surface plane pour la culture cellulaire dans la chambre inférieure.
Nous avons réalisé des monocultures endothéliales et des co-cultures de hCMEC/D3 et HBVP et de cellules de type EECM-BMEC dérivées de hiPSC IMR90-4 et de BPLC et acquis des images de phase à l’aide d’un microscope à contraste de phase Nikon Eclipse Ts2 et d’un objectif 10x (Figure 2). Les densités de semis optimales pour la culture de cellules primaires sont présentées (images prises 1 jour après l’ensemencement), ainsi que les HBVP sous-ensemencés (Figure 2A). Les images finales de la phase de coculture et de monoculture (6 jours de culture de cellules endothéliales) peuvent être difficiles à distinguer (Figure 2C), et la confirmation de la réussite de la co-culture de cellules primaires peut nécessiter une coloration par immunofluorescence (voir la section 3 du protocole). Les densités de semis de BPLC faibles, élevées et optimales dérivées des hiPSC sont également illustrées (figure 2B). La co-culture dérivée de hiPSC est plus claire à distinguer en imagerie par contraste de phase que les co-cultures primaires (Figure 2D). Un faible ensemencement BPLC entraîne une mauvaise couverture du péricyte et une agglutination du péricyte, tandis qu’un sursemis entraîne le décollement de la couche péricytaire de la membrane. De plus, un échange trop rapide du milieu dans la chambre inférieure peut entraîner une perte de péricyte, car ces cellules sont très sensibles au cisaillement. La couverture optimale par les péricytes est de ~90% pour un modèle BHE, sans lacunes dans la couche endothéliale.
Des images représentatives de la co-culture de cellules hiPSC immunocolorées sont illustrées à la figure 3 (culture de cellules endothéliales de 6 jours). Les BPLC dérivés d’IMR90-4 ont été colorés pour le marqueur péricytaire PDGFRβ, et les cellules de type EECM-BMEC dérivées d’IMR90-4 ont été colorées pour le marqueur de jonction adhérente VE-cadhérine. Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux. Les images ont été acquises sur un microscope confocal à disque rotatif à l’aide d’un objectif LWD 40x avec des tranches de 0,2 μm et traitées avec Imaris. Les deux couches cellulaires peuvent être visualisées même si la fine nanomembrane n’est pas visible.
Nous avons effectué le test de perméabilité des petites molécules basé sur l’échantillonnage en utilisant les mêmes conditions expérimentales dans deux laboratoires physiquement distants de l’Université de Berne, en Suisse, et de l’Université de Rochester, NY, aux États-Unis, afin de démontrer la reproductibilité interlaboratoires des résultats (Figure 4)34. Des cellules de type EECM-BMEC dérivées de l’IMR90-4 de hiPSC ont été cultivées dans le dispositif μSiM pendant 2, 4 ou 6 jours et sur des filtres transwell pendant 6 jours. L’essai a été effectué à l’aide de 150 μg/mL de jaune de lucifer (457 Da) dans les deux laboratoires. Une grande variabilité de la perméabilité des cellules endothéliales cultivées pendant 2 jours dans le dispositif indique que 2 jours de culture étaient insuffisants pour la maturation de la barrière. Il n’y avait pas de différences significatives de perméabilité entre les laboratoires lors de la maturation de la barrière, à partir de 4 jours. Nous avons également montré que la perméabilité des cellules endothéliales cultivées dans des filtres μSiM et transwell pendant 6 jours correspondait à celles publiées précédemment40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Figure 1 : Étapes de l’assemblage du μSiM. (A) Préparez la puce en la plaçant sur le luminaire A1. Placez la tranchée de copeaux vers le haut pour un dispositif de tranchée final. Placez la tranchée de copeaux vers le bas pour un dispositif de tranchée final. (B) Coller le composant 1 à la puce en retirant les masques de protection du composant 1 et en le plaçant face vers le bas dans FA1. Collage en appliquant une pression avec le luminaire A2. (C) Coller le composant 2 et le composant 1 en retirant le composant 2 de sa feuille et en décollant les couches protectrices supérieures. Placez le canal vers le haut dans le luminaire B1 et placez le composant 1 au-dessus du composant 2 face vers le haut. Collage en appliquant une pression avec le luminaire B2. Abréviations : FAn = luminaire An ; FBn = luminaire Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma de coculture et images représentatives de contraste de phase de la culture cellulaire dans les dispositifs. (A) Emplacement de l’ensemencement des cellules péricytaires et endothéliales. (B) Vue latérale de l’emplacement des cellules dans la tranchée de la puce membranaire. (C) Images représentatives des densités de semis faibles et optimales pour la lignée cellulaire endothéliale cérébrale primaire HBVP et hCMEC/D3. Les images ont été acquises 1 jour après l’ensemencement (HBVP) et 2 h après l’ensemencement (hCMEC/D3). (D) Images représentatives de densités d’ensemencement faibles, élevées et optimales pour les cellules de type péricyte cérébral dérivées de hiPSC. Les images ont été acquises 1 jour après l’ensemencement. (E) Images représentatives de la co-culture finale de HBVP et hCMEC/D3 et de la monoculture hCMEC/D3. Les images ont été acquises 8 jours après l’ensemencement de l’HBVP et 7 jours après l’ensemencement de l’hCMEC/D3. (F) Images représentatives de la co-culture de cellules de type BPLC et EECM-BMEC qui a échoué et qui a réussi, et de la monoculture de cellules de type EECM-BMEC. Les images ont été acquises 7 jours après l’ensemencement BPLC et 6 jours après l’ensemencement EECM-BMEC. Les cultures BPLC sous-ensemencées n’ont pas une couverture suffisante, tandis que les cultures BPLC surensemencées deviendront trop confluentes et commenceront à s’agglutiner/se rétracter. Barres d’échelle = 100 μm (C-F). Abréviations : HBVP = péricytes vasculaires du cerveau humain ; hiPSC = cellule souche pluripotente induite par l’homme ; BPLCs = cellules de type péricyte cérébrale dérivées de hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives de la co-culture de cellules dérivées de hiPSC immuno-colorées dans des dispositifs. Les cellules ont été colorées pour le marqueur des cellules endothéliales VE-cadhérine (vert), le marqueur péricytaire PDGFRβ (rouge) et la coloration nucléaire (bleu). Deux couches de cellules peuvent être vues à proximité l’une de l’autre, séparées uniquement par une fine nanomembrane de nitrure de silicium (la flèche blanche marque l’emplacement de la membrane sur l’image de gauche). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : hiPSC = cellule souche pluripotente induite par l’homme ; PDGFRβ = récepteur bêta du facteur de croissance dérivé des plaquettes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Figure 4 : Essai de perméabilité des petites molécules basé sur l’échantillonnage. (A) Schéma du déroulement expérimental. (B) Démonstration de la reproductibilité interlaboratoires entre deux laboratoires physiquement distants de l’Université de Berne (UniBe), Suisse, et de l’Université de Rochester (UR), NY, USA : des cellules endothéliales dérivées de hiPSC ont été cultivées dans le dispositif μSiM pendant 2, 4 ou 6 jours et dans des filtres transwell pendant 6 jours. Le test de perméabilité a été effectué à l’aide de 150 μg/mL de jaune de lucifer (457 Da). La barre rouge indique les données de perméabilité à la fluorescéine de sodium (376 Da) publiées précédemment des mêmes cellules endothéliales dérivées de hiPSC cultivées pendant 6 jours dans des filtres transwell40. N = 4 à 16 par groupe. Une ANOVA bidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey a été utilisée, et les comparaisons n’ont été affichées que pour p &lt; 0,05 pertinentes. (C) Démonstration de la réponse cytokinique à l’aide de cellules de type EECM-BMEC dérivées de hiPSC cultivées dans le μSiM pendant 2 jours ; 0,1 ng/mL TNFα + 2 UI/mL IFNγ) ou un témoin du milieu (non stimulé, NS) a été ajouté à la chambre supérieure pendant 20 heures avant l’essai de perméabilité à l’aide de 150 μg/mL de jaune de lucifer. N = 3 par groupe. Test t de l’étudiant, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Surface d’ensemencement de la chambre supérieure</td>
			<td>Volume du puits supérieur</td>
			<td>Surface d’ensemencement de la chambre inférieure</td>
			<td>Volume du canal inférieur</td>
		</tr><tr><td>~37 millimètre2</td>
			<td>100 μL (peut contenir ≥115 μL)</td>
			<td>~42 millimètre2</td>
			<td>10 μL (pipette 20 μL pour éviter les bulles)</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Surface et volumes critiques en μSiM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cible</td>
			<td>Fixateur</td>
			<td>Solution de blocage</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr><tr><td>VE-cadhérine</td>
			<td>4 % de PFA ou 100 % de MeOH</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Tx-100 ou 10 % GS + 0,3 % Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4 % de PFA ou 100 % de MeOH</td>
			<td>5 % GS + 0,3-0,4 % Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5 à 10 % GS + 0,3 % Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5 à 10 % GS + 0,3 % Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Occludine</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5 à 10 % GS + 0,3 % Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4 % de PFA</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2</td>
			<td>4 % de PFA</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Souris α chèvre IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Souris α chèvre IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Anticorps et méthodes de coloration validés pour l’immunocytochimie en co-culture dans les dispositifs μSiM. Abréviations : PFA = paraformaldéhyde ; MeOH = méthanol ; GS = sérum de chèvre.
Fichier supplémentaire 1 : Modèle de calcul de la valeur de perméabilité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce rapport fournit des protocoles d’assemblage, de culture cellulaire et de dosage sur la plateforme μSiM pour la construction de modèles de barrière hémato-encéphalique.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Nous développons un modèle gastro-intestinal tissulaire de la barrière hémato-encéphalique pour comprendre l’impact de la septicémie sur le cerveau et la contribution des facteurs transmissibles par le sang. Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Nous prévoyons d’évaluer la contribution des facteurs génétiques à la susceptibilité de certaines populations de patients.Les défis expérimentaux actuels au sein de la communauté des puces tissulaires sont la reproductibilité des résultats et l’adoption de techniques par des laboratoires externes. La conception unique des puces de tissu, les petits volumes dans les puces de tissu et l’absence de tests fonctionnels standard contribuent tous à ces défis et limitent souvent les utilisateurs à des tests à base de fluorescence comme résultat principal. Les dispositifs Micro SIMM offrent une modularité pour une modélisation in vitro polyvalente, une surface lumineuse en verre idéale pour l’imagerie de style de vie haute résolution et une nanomembrane ultra syn 100 nanomètres, hautement produite, garantissant une diaphonie transparente des facteurs solubles et des tests de perméabilité précis.Avec le micro simm, nous avons vu que des types de cellules spécifiques ont tendance à produire plus de protéines matricielles qui fournissent un échafaudage de soutien autour des vaisseaux sanguins du cerveau. Nous pouvons maintenant nous demander si l’inflammation amène ces mêmes cellules à renforcer ou à décomposer leurs matrices, altérant ainsi l’intégrité de la barrière. À l’avenir, nous ajouterons un autre compartiment au modèle avec des cellules vertes telles que les astrocytes et les microglies pour étudier comment ces cellules interagissent avec la barrière hémato-encéphalique dans les cas d’inflammation systémique comme la septicémie.Nous prévoyons également d’étudier d’autres causes d’inflammation systémique comme le délire postopératoire, superposé à la démence.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Création de modèles humains de la barrière hémato-encéphalique (BHE) peut bénéficier des recherches sur les conditions du cerveau associées à l'échec du Bureau. Nous décrivons ici une technique améliorée pour la préparation d'un modèle de BBB de contact, ce qui permet de co-culture d'astrocytes humains et les cellules endothéliales du cerveau sur les côtés opposés d'une membrane poreuse.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

Ici, nous décrivons un modèle murin in vitro de la barrière hémato-encéphalique qui utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, en mettant l’accent sur les conséquences sur l’intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales lors de l’interaction avec les cellules T activées.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Nous présentons ici un protocole décrivant la mise d’un cellulo en BBB (hémato-encéphalique)-culture polyester membrane poreuse Minibrain insérer le système afin d’évaluer le transport des biomolécules ou des agents infectieux à travers un BBB humain et leur impact physiologique sur les neurones voisins.

Un modèle d’Interface humaine hémato-encéphalique pour étudier les passages barrière de pathogènes ou de médicaments et de leurs Interactions avec le cerveau

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une unité neurovasculaire multicellulaire régulant étroitement l’homéostasie cérébrale. En combinant les iPSC humains et les technologies d’organes sur puce, nous avons généré une puce BBB personnalisée, adaptée à la modélisation des maladies et aux prédictions de pénétrabilité des médicaments du SNC. Un protocole détaillé est décrit pour la génération et l’exploitation de la puce BBB.

Génération d’une puce de barrière de sang-brain basée sur iPSC

Ce protocole décrit une méthode pour établir un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique humaine (BHE). Les cellules endothéliales et les péricytes sont ensemencés de chaque côté d’un filtre à insert (compartiment sanguin), et les astrocytes sont ensemencés dans le puits inférieur (compartiment cérébral). Le modèle caractérisé a été utilisé pour des expériences de transport de nanoparticules.

Un système cellulaire à triple culture modélisant la barrière hémato-encéphalique humaine

La barrière hémato-encéphalique joue un rôle crucial dans le maintien d’un environnement cérébral stable et sain. Le dysfonctionnement de la BHE est associé à de nombreuses maladies neurologiques. Nous avons développé un modèle 3D dérivé de cellules souches de la BHE pour étudier la pathologie cérébrovasculaire, l’intégrité de la BHE et la façon dont la BHE est modifiée par la génétique et la maladie.

Reconstruction de la barrière hémato-encéphalique in vitro pour modéliser et cibler thérapeutiquement les maladies neurologiques

Ce protocole décrit une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes qui intègre le format à puits ouvert avec des capacités d’écoulement de fluide. Cette plateforme est compatible avec les protocoles standard et permet des transitions réversibles entre les modes de culture à puits ouvert et microfluidique, répondant aux besoins des laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Transformer des modèles de tissus de barrière statique en systèmes microphysiologiques dynamiques

Découvrez la modélisation de la barrière hémato-encéphalique avec la plateforme MicroSiM utilisant des cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode permet d'étudier l'impact de la sepsis sur le cerveau.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

Explorer plus de vidéos