Name: Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Découvrez une approche simplifiée d'imagerie intravitale utilisant un microscope confocal inversé pour suivre la dynamique des cellules cutanées chez la souris vivante. Cette méthode accessible permet d'étudier l'homéostasie et la progression des maladies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Valentina Greco pour les souris K14-mCherry-H2B. Nous sommes reconnaissants à l’atelier d’usinage du département de physique de l’Université Emory d’avoir généré les disques de lamelles en verre. Ce travail a été financé par le prix de développement de carrière #IK2 BX005370 du service BLRD du ministère des Anciens Combattants des États-Unis à LS, les prix NIH RF1-AG079269 et R56-AG072473 à MJMR, et le prix I3 Emory SOM/GT pour le calcul et l’analyse de données à MJMR.

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives de l’Université Emory et du centre médical des anciens combattants d’Atlanta sur les soins et l’utilisation des animaux et a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
1. Installation de l’insert d’imagerie en direct sur la platine du microscope inversé
<ol><li>Construisez l’insert à l’aide de fichiers .stl (Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3) en spécifiant les dimensions et la conception 3D (voir Figure 1 et Figure 2A), une imprimante 3D et de l’acide polylactique (PLA).</li>
	<li>Placez délicatement l’insert (Figure 2B,C) dans la grande rainure de la platine du microscope (Figure 2C et Figure 3A). Utilisez des vis pour fixer l’insert à l’aide de quatre trous de vis situés dans chaque coin de l’insert (Figure 2B-C). REMARQUE : L’insert est bidirectionnel et peut être tourné à 180° en fonction de l’orientation de la platine du microscope et de l’appareil d’anesthésie.</li>
	<li>Faites glisser la plaque chauffante dans le bouchon d’insertion, côté vers le bas (Figure 2D) de manière à ce que l’appareil repose sur les rainures d’insertion inférieures, l’orifice de la fiche passant sous la platine (Figure 3B).</li>
	<li>Alignez l’ouverture circulaire rainurée de l’insert avec un objectif d’immersion d’huile de silicone 40x (Figure 3C) et appliquez de l’huile de silicone au centre de l’objectif.<ol><li>Si l’imagerie s’étend sur des périodes plus longues (>1 h), appliquez une généreuse cuillerée d’huile qui persistera à l’interface lamelle/objectif tout au long de l’imagerie. Ne laissez pas l’huile se répandre sur les bords de l’objectif.</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’une seringue, appliquez une petite quantité de graisse sous vide le long de l’ouverture circulaire rainurée et posez le disque de lamelle sur le dessus pour sceller l’insert (Figure 3D). REMARQUE : Le disque de lamelles est créé en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire à fond en verre de 35 mm x 10 mm (effectuée par un atelier d’usinage).</li>
	<li>Soulevez l’objectif 40x jusqu’à ce que l’huile embrasse le fond de la lamelle en verre.</li>
</ol>2. Configuration de l’isoflurane et préparation de la souris
<ol><li>Positionnez les composants électroniques du vaporisateur à faible débit (chambre d’anesthésie, tuyau, vaporisateur, cartouche de charbon) de manière à permettre au cône nasal et à la tubulure attachée d’atteindre l’insert (Figure 3A). ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec précaution pour éviter les déversements et minimiser l’exposition humaine.</li>
	<li>Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane avant utilisation et enregistrez-la. Fixez le bouchon du vaporisateur électronique à la bouteille d’isoflurane.</li>
	<li>Connectez le cordon d’alimentation au vaporisateur électronique. Fermez les clips bleus du cône de nez et ouvrez les clips blancs de la chambre d’induction pour permettre à l’air de circuler à travers la chambre dans la cartouche de charbon de bois. Retirez le chapeau d’air ambiant rouge du côté gauche de la machine pour permettre à l’air de circuler.</li>
	<li>Laisser le système se réchauffer pendant 5 minutes à 200 mL/min (faible débit) et 2 % d’isoflurane. REMARQUE : Bien que le réglage du cône de nez soit sélectionné, la ligne de cône de nez bleu doit rester fermée et la ligne blanche de la chambre d’induction doit rester ouverte.</li>
	<li>Une fois que le système est correctement équilibré, purgez les conduites pour éliminer l’isoflurane restant de la chambre.</li>
	<li>Placez la souris dans la chambre d’induction et sélectionnez High Flow. Terminez toute la préparation de la souris (c.-à-d. l’épilation, l’administration topique de médicaments, l’application d’une pommade pour les yeux, etc.) avant de poser le corps de l’animal sur l’insert. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée à l’aide de la méthode du réflexe de pincement des orteils.<ol><li>Avec la jambe tendue, utilisez un ongle pour pincer fermement l’orteil sans causer de dommages physiques. Si la souris présente une réaction positive au stimulus (c’est-à-dire une rétraction des jambes, une contraction du pied, etc.), continuez à administrer un anesthésique dans la chambre jusqu’à ce qu’aucune réaction ne soit observée. Une fois correctement anesthésiée, la fréquence respiratoire de la souris devrait ralentir à ~55-65 respirations par minute18.</li>
	</ol></li>
	<li>Lorsque la souris est complètement anesthésiée, sélectionnez à nouveau High Flow (Débit élevé) pour arrêter l’administration d’isoflurane. Purgez la chambre avant de l’ouvrir et ajustez les clips (bleu : ouvert ; blanc : fermé) pour délivrer l’isoflurane à travers le cône nasal. Sélectionnez Low Flow (Faible débit) pendant que le cône nasal est attaché à la souris pour continuer à administrer de l’isoflurane.</li>
	<li>Vissez le tube d’isoflurane avec le cône de nez attaché à travers le support de tube d’angle de l’insert (Figure 3A et Figure 5).</li>
</ol>3. Placement de la souris sur l’insert pour l’imagerie intravitale
<ol><li>Branchez la plaque chauffante sur le contrôleur (contenant une sonde anale attachée), allumez-la et laissez-la atteindre 36 °C (Figure 4A).</li>
	<li>Retirez la souris anesthésiée de la chambre d’induction et posez-la sur la plaque chauffante (Figure 4B et Figure 5A). Effectuez le transfert de la chambre à l’insertion rapidement pour minimiser le temps pendant lequel la souris est active sans anesthésie par inhalation.</li>
	<li>Fixez le cône de nez sur la souris (Figure 4B, C et Figure 5). Si nécessaire, utilisez du ruban adhésif pour sécuriser davantage l’angle et le positionnement du cône de nez.</li>
	<li>Insérez la sonde anale et ajustez la température du contrôleur jusqu’à ce que la température du corps de la souris soit stable à ~36 °C (Figure 4A,B). Une fois que la souris est correctement positionnée, utilisez une pellicule plastique pour emprisonner la chaleur, si nécessaire, afin de maintenir davantage la température corporelle appropriée (Figure 4C).</li>
	<li>Positionnez la souris de manière à ce que la tête s’aligne avec le disque de lamelle et immobilisez l’oreille au centre de la lamelle en verre à l’aide d’un clip d’oreille en métal (Figure 5A,B) ou d’un ruban adhésif (Figure 5C). REMARQUE : La pression du clip d’oreille métallique sur l’oreille peut être ajustée en desserrant la vis qui fixe le clip à l’insert. Un ressort métallique peut être ajouté pour une flexibilité accrue du serrage des clips.<ol><li>Pour modifier l’emplacement du clip d’oreille, dévissez le boulon à l’aide d’une clé Allen de 2,5 mm et transférez-le sur le site secondaire (Figure 2B,C). Lors du remontage du clip d’oreille, placez le clip contre l’insert, suivi de la rondelle sur le dessus. Utilisez un boulon pour fixer solidement le clip avec une légère force pour faire pivoter le clip.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustez le positionnement z de l’objectif jusqu’à ce que les cellules se trouvent à l’intérieur du point focal (Figure 6A,D). Définissez les paramètres z-stack et time-lapse en fonction des objectifs expérimentaux et commencez l’acquisition d’images. REMARQUE : Si la configuration correcte est obtenue, l’oreille de la souris peut être photographiée pendant au moins 3 h consécutifs (Figure 6A',D').<ol><li>Une fois que les limites de la pile z sont définies, ajustez la puissance et le gain du laser pour vous assurer qu’aucun plan z n’est sursaturé afin de minimiser le photoblanchiment. Déterminez les paramètres de time-lapse à l’aide de l’épaisseur totale de la pile z, du nombre d’étapes (échantillonnage de Nyquist recommandé) et des intervalles de temps.</li>
		<li>Déterminer les paramètres d’imagerie (intervalles de temps, temps total d’imagerie, etc.) à l’aide de plusieurs facteurs, y compris la viabilité de l’animal sous anesthésie, le photoblanchiment/phototoxicité induit par le laser et l’objectif de l’imagerie en direct (c.-à-d. la dynamique de la division cellulaire, les interactions cellule-cellule, etc.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Arrêt de l’imagerie
<ol><li>Allumez le coussin chauffant à circulation d’eau et réglez-le sur Cycle continu et 35 °C pendant au moins 30 minutes avant la fin de l’acquisition de l’image.</li>
	<li>Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez Low Flow sur le vaporisateur électronique pour arrêter l’administration d’isoflurane et déplacez la souris vers un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.</li>
	<li>Une fois réveillée, replacez la souris dans le récipient de transfert tout en continuant à la maintenir sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement ambulatoire. Surveillez constamment la souris lorsqu’elle est sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle réponde.</li>
	<li>Sur le vaporisateur électronique, cliquez sur Sélectionner le menu > Contrôle anesthésique > vide. Retirez le flacon d’isoflurane du système et replacez le bouchon du fabricant sur le flacon.</li>
	<li>Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane et de la cartouche de charbon de bois et entrez les poids dans le journal. Une fois que la cartouche de charbon de bois pèse 50 g de plus que la mesure de base, jetez-la et remplacez-la par une nouvelle unité. Remettez l’isoflurane dans le coffre-fort.</li>
	<li>Retirez le disque de lamelle et essuyez-le avec du papier pour lentilles et une solution pour lentilles. Rangez-le correctement pour éviter les rayures et le réutiliser.</li>
	<li>Retirez la tubulure d’anesthésie du support d’insertion et dévissez l’insert de la platine du microscope.</li>
</ol>

Imagerie intravitale à l’aide d’un microscope inversé pour suivre la dynamique des cellules cutanées

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui facilite l’imagerie intravitale stable et à long terme des épithéliums cutanés intacts de souris sur des microscopes confocaux inversés. Cette invention est fabriquée en PLA, qui est le matériau imprimable en 3D le plus courant et le moins coûteux ; tous les coûts d’impression 3D en interne pour cet insert s’élèvent à 5 < $. Les deux pièces d’insertion séparées (Figure 1, Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplé...

La microscopie intravitale est un outil puissant qui permet de surveiller les comportements cellulaires dans leurs environnements in vivo non perturbés. Cette méthode unique a fourni des informations clés sur le fonctionnement interne de systèmes d’organes complexes de mammifères, notamment le poumon1, le cerveau2, le foie3, la glande mammaire4, l’intestin5 et la peau6. De plus, cette approche a révélé des altérations du comportement cellulaire au cours du développement de la tumeur7, de la cicatrisation des plaies8,9, de l’inflammation10 et d’autres pathologies diverses in situ. Dans cette étude, nous nous concentrons sur l’amélioration de l’accessibilité de la microscopie intravitale pour imager la dynamique épithéliale et stromale vivante dans la peau intacte de souris. La compréhension des comportements cellulaires de la peau des mammifères est d’une grande importance clinique en raison de la remarquable capacité de régénération et de tumoricité de ce tissu.
L’imagerie intravitale chez la souris a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux en raison de leur capacité à fournir une imagerie à haute résolution à des profondeurs tissulaires >100 μm11,12. Néanmoins, ces instruments n’ont pas la polyvalence et l’accessibilité plus générale des microscopes confocaux inversés, qui sont plus conviviaux et plus rentables, permettent d’imager des cellules en culture, ne nécessitent pas d’obscurité complète lors de l’acquisition d’images et sont généralement plus sûrs, entre autres avantages notables13,14. Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui améliore considérablement l’accessibilité de l’imagerie intravitale en adaptant cette approche aux microscopes confocaux inversés.
Ici, nous présentons une conception d’insert de platine personnalisée imprimée en 3D qui intègre plusieurs caractéristiques clés pour faciliter l’imagerie intravitale stable et à long terme de la peau de l’oreille de souris sur un microscope confocal inversé (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Figure 5). Ces caractéristiques spécialisées comprennent un trou d’objectif décalé qui permet au corps entier d’une souris adulte de reposer entièrement à plat pendant l’imagerie. Cela minimise les interférences vibratoires des mouvements du corps de la souris sur l’imagerie et élimine le besoin d’administrer de la kétamine et de la xylazine pour atténuer la respiration, une pratique souvent associée à l’imagerie intravitale6. De plus, des supports d’angle sur l’insert positionnent correctement un cône nasal isoflurane pour qu’il s’aligne avec le visage de la souris, un clip d’oreille en métal immobilise l’oreille de la souris sur un disque de lamelle construit sur mesure, et une plaque chauffante de biofeedback en boucle fermée amovible en option affleure dans l’insert pour soutenir la température du corps de la souris pendant les longues sessions d’imagerie. Le disque de lamelles personnalisé, qui fournit une surface plane essentielle pour que la tête et l’oreille de la souris puissent être posées à plat, a été généré dans un atelier d’usinage en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire générique contenant des lamelles. L’utilisation d’une lentille d’immersion dans l’huile de silicone 40x (ouverture numérique de 1,25 [N.A.], distance de travail de 0,3 mm) en conjonction avec le disque de lamelle et l’insert de platine personnalisé permet d’obtenir des images haute résolution à >50 μm de profondeur dans le derme de l’oreille.
Pour tester la fonctionnalité de ce nouvel insert de platine de microscope inversé, nous avons capturé des empilements z couvrant toutes les couches épithéliales épidermiques sur une période de 3 h dans l’oreille d’une souris adulte transgénique vivante K14-H2B-mCherry15 (les noyaux épithéliaux de cette lignée de souris contiennent une étiquette fluorescente rouge) (Figure 6A-A'). Nous avons également capturé des piles z couvrant plusieurs couches de fibroblastes dans le derme de la peau sur une période de 3 h dans l’oreille d’un Pdgfra-rtTA16 transgénique vivant ; pTRE-H2B-GFP17 souris adulte (les noyaux des fibroblastes de cette lignée de souris contiennent un marquage fluorescent vert après induction de la doxycycline) (Figure 6B-D'). Nos données à haute résolution démontrent une stabilité constante par l’absence de dérive dans les plans x, y et z, prouvant ainsi l’efficacité de ce nouvel outil d’imagerie intravitale pour une utilisation sur des microscopes inversés. Il est important de noter que les dimensions de cet insert de platine imprimé en 3D peuvent être ajustées, comme décrit dans les fichiers supplémentaires 1, 2 et 3, pour s’adapter à n’importe quel microscope inversé, et le positionnement de l’ouverture de l’objectif peut être déplacé vers d’autres emplacements dans l’insert pour mieux s’adapter à l’imagerie d’un tissu particulier et/ou d’un modèle animal d’intérêt. Cette invention peut ainsi permettre à des laboratoires individuels, ou à des chercheurs disposant d’un accès confocal à une installation centrale, d’adapter cet outil à leurs besoins uniques en matière d’imagerie intravitale, rationalisant ainsi l’évaluation de diverses biologies cellulaires in vivo.

<table><tbody><tr><td>Imprimante 3D</td><td>Qudi Tech</td><td>i-Fast</td><td>Impressions 3D en utilisant le matériau PLA</td></tr><tr><td>40x 1.25NA lentille d’objectif en silicone</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR Laser Scanning Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Swab</td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>Application de crème/pommade</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Induit le marquage GFP des noyaux de fibroblastes dans Pdgfra-rtTA ; Souris pTRE-H2B-GFP</td></tr><tr><td>Tournevis à tête plate (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Insert de fixation sur la platine</td></tr><tr><td>de microscope Vis à tête plate x 4 (#6-32)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Insert de vis dans la platine de microscope</td></tr><tr><td>Plat de culture à fond de verre</td><td>chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1811-002</td><td>Modifié en supprimant les parois de la parabole pour l’utiliser comme disque de lamelle compatible avec l’insert sous tension ; disque de 35 mm de large contenant une lamelle en verre de 20 mm de large ; les parois de la parabole ont été retiré par l’atelier d’usinage</td></tr><tr><td>Contrôleur de plaque chauffante</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>Contrôleur de température animale - Basse tension ; fixation de sonde anale pour la surveillance de la température corporelle de la souris</td></tr><tr><td>Clé hexagonale (1,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Pour le réglage de la vis de réglage M3</td></tr><tr><td>Clé hexagonale (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Régler la tension sur le clip d’oreille en métal</td></tr><tr><td>Insert</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>d’imagerie intravitalIsoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td><td>Anesthésie de souris</td></tr><tr><td>Ruban d’étiquetage (ou Scotch Tape)</td><td>VWR</td><td>10127-458</td><td>Alternative à l’attache d’oreille en métal pour immobiliser l’oreille à la lamelle</td></tr><tr><td>Attache</td><td></td><td></td> en métal <td>utilisée comme clip d’oreille</td></tr><tr><td>Souris : C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID : IMSR_JAX :034459</td><td>Promoteur spécifique du fibrroblaste à l’origine de l’expression de rtTA inductible par la doxycycline</td></tr><tr><td>Souris : K14-H2BPAmCherry</td><td>Avec l’aimable autorisation du Dr Valentina Greco de l’Université</td><td></td> de Yale <td>Labels les noyaux des cellules épithéliales épidermiques avec mCherry ; désigné dans le texte comme « K14-H2B-mCherry"</td></tr><tr><td>Souris : pTRE-H2B-GFP : STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID : IMSR_JAX :005104</td><td>&nbsp ; Marque les noyaux de fibroblastes avec GFP lorsqu’il est combiné avec Pdgfra-rtTA et induit avec de la doxycycline</td></tr><tr><td>Enveloppe d’étanchéité polyvalente</td><td>Glad Enhance</td><td></td><td>mouse</td></tr><tr><td>chaleur Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>Lubrifiant pour les yeux</td></tr><tr><td>Vis de réglage x 3 (M3 ; 6 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>Fixation pour module de plaque chauffante</td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td></td><td></td> en silicone <td>Appliquée à 40x silicone objectif</td></tr><tr><td>Plaque chauffante pour petits animaux</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>Fournit de la chaleur à l’animal</td></tr><tr><td>Vaporisateur électronique à faible débit Somnoflow</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td>Anesthésie de souris</td></tr><tr><td>Graisse sous vide</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP1095</td><td>Scelle le disque de lamelle pour insérer l’épilation</td></tr><tr><td>Veet</td><td></td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Coussin chauffant à circulation d’eau</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td><td>pour la renaissance de la souris post-imagerie</td></tr></tbody></table>

approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Comprendre les comportements normaux et aberrants des cellules in vivo est nécessaire pour développer des interventions cliniques visant à contrecarrer l’initiation et la progression de la maladie. Il est donc essentiel d’optimiser les approches d’imagerie qui facilitent l’observation de la dynamique cellulaire in situ, où la structure et la composition des tissus restent inchangées. L’épiderme est la barrière la plus externe de l’organisme, ainsi que la source des cancers humains les plus répandus, à savoir les carcinomes cutanés de la peau. L’accessibilité des tissus cutanés offre une occasion unique de surveiller les comportements des cellules épithéliales et dermiques chez les animaux intacts à l’aide de la microscopie intravitale non invasive. Néanmoins, cette approche d’imagerie sophistiquée a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux, qui représentent une barrière importante à l’entrée pour la plupart des chercheurs. Cette étude présente un insert de platine de microscope conçu sur mesure, imprimé en 3D, adapté à une utilisation avec des microscopes confocaux inversés, rationalisant l’imagerie intravitale à long terme de la peau de l’oreille chez des souris transgéniques vivantes. Nous pensons que cette invention polyvalente, qui peut être personnalisée pour s’adapter à la marque et au modèle de microscope inversé de votre choix et adaptée à l’imagerie de systèmes d’organes supplémentaires, s’avérera inestimable pour l’ensemble de la communauté de la recherche scientifique en améliorant considérablement l’accessibilité de la microscopie intravitale. Cette avancée technologique est essentielle pour renforcer notre compréhension de la dynamique des cellules vivantes dans des contextes normaux et pathologiques.

L’assemblage correct de l’insert d’imagerie en direct sur un microscope confocal inversé et l’orientation appropriée d’une souris transgénique au sommet de l’insert sont validés par l’acquisition d’empilements z de tissu auriculaire vivant marqué par fluorescence sur une période ≥1 h avec un minimum de signes de dérive dans les axes x, y et z. Les images doivent être capturées à intervalles réguliers (le temps d’intervalle dépendra de la question biologique, de la force du signal de fluorescence, etc.) afin que la dynami...

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Nous avons développé un outil permettant de réaliser une imagerie intravitale sur des souris vivantes à l’aide d’un microscope confocal inversé. Cela nous permet de suivre la dynamique des cellules de la peau tout au long de l’homéostasie et de comparer les comportements cellulaires au cours de l’apparition et de la progression de la maladie. La microscopie multiphotonique est la principale approche appliquée pour réaliser le suivi des cellules intravitales.Cependant, les inconvénients de ces microscopes comprennent une polyvalence d’imagerie quotidienne limitée, un coût élevé et une complexité technique. Notre nouvel outil permet l’utilisation de microscopes confocaux inversés polyvalents pour l’imagerie intravitale in vivo. En modifiant le fichier de conception, les dimensions de l’insert de platine peuvent être personnalisées pour s’adapter à n’importe quelle marque de microscope inversé.Le trou d’objectif peut être redimensionné et repositionné pour s’adapter à n’importe quel modèle animal et tissu de votre choix.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Cette vidéo montre la visualisation des lymphocytes intra-épithéliales (IEL) γδ chez des souris transgéniques à l’aide de la microscopie confocale. L’intervention chirurgicale consiste à créer une ligne de perforation et à faire une incision longitudinale pour exposer la muqueuse intestinale et les villosités. Les souris transgéniques expriment des protéines rapporteures exclusivement dans des IEL γδ, ce qui permet leur suivi. L'imagerie intravitale capture le mouvement dynamique des IEL γδ...

Visualisation intravitale des lymphocytes intra-épithéliales gamma delta

Une nouvelle approche combinant la greffe intraoculaire et la microscopie confocale permet longitudinale, non-invasive imagerie en temps réel avec une seule cellule de résolution au sein des tissus...

Transplantation dans la chambre antérieure de l&#39;oeil pour longitudinale, non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie avec une seule cellule de résolution en temps réel

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Découvrez une approche simplifiée d'imagerie intravitale utilisant un microscope confocal inversé pour suivre la dynamique des cellules cutanées chez la souris vivante. Cette méthode accessible permet d'étudier l'homéostasie et la progression des maladies.

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé (Vidéo) | JoVE Journal

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Explorer plus de vidéos