Name: Utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez des protocoles éducatifs à faible coût pour visualiser l'accumulation de glycogène et l'intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans. Ces méthodes permettent aux étudiants d'étudier le métabolisme et le vieillissement.

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REMARQUE : La bactérie Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) et les souches sauvages de Bristol N2 peuvent être obtenues auprès du CGC, Université du Minnesota, États-Unis, ou grâce à un don d’un laboratoire de C. elegans . Pour la sécurité des chercheurs, il est impératif d’utiliser des équipements de protection individuelle. Bien que les concentrations de réactifs comme l’hypochlorite et l’hydroxyde de sodium soient faibles, il est essentiel de porter l’EPI recommandé, comme souligné dans le manuscrit, afin de minimiser les risques potentiels associés à ces produits chimiques.
1. Teneur en glycogène
<ol><li>Préparation des plaques d’essai<ol><li>Préparezsix plaques de gélose NGM de 60 mm x 15 mm (10 mL de gélose gélose au milieu de croissance des nématodes, NGM, comme décrit dans le tableau supplémentaire 1) par souche de ver et laissez-les sécher pendant 1 jour à température ambiante. Gardez les plaques fermées pour éviter toute contamination.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de culture liquide d’E. coli OP50 (avec une densité optique = 0,600, environ à une longueur d’onde de 600 nm) par plaque pour inoculer un total de quatre plaques NGM de 60 mm x 15 mm par souche dans la hotte d’écoulement. Laisser incuber les plaques fermées à 37 °C pendant 1 jour avant utilisation. REMARQUE : Préparez six plaques (étape 1.1), mais n’en inoculez que 4 avec la bactérie E. coli OP50. Réservez les deux plaques restantes à 4 °C pour une utilisation ultérieure lorsque vous placez les vers dans des conditions de famine. Cette analyse peut être effectuée en double.</li>
		<li>Le jour de l’essai, ajouter 200 μL de D-glucose 0,025 M à deux plaques de gélose NGM (6 mm x 15 mm) par souche qui ont déjà été ensemencées avec la bactérie E. coli OP50. Laissez sécher les plaques à température ambiante dans la hotte d’évacuation. REMARQUE : Les plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 peuvent également être séchées à proximité de lampes à alcool comme alternative à l’utilisation d’une hotte à flux.</li>
	</ol></li>
	<li>Synchronisation<ol><li>Environ 3 jours avant la synchronisation, transférez 3 à 4 morceaux (3 cm x 3 cm) d’une gélose d’entretien NGM avec C. elegans Bristol N2 (type sauvage) à différents stades (environ 500 vers par morceau) dans une nouvelle plaque (150 mm x 90 mm) qui a été préalablement ensemencée avec la bactérie E. coli OP50.</li>
		<li>Placez la nouvelle plaque avec les vers dans un environnement contrôlé à 20 °C et maintenez l’humidité &gt;95% pendant 3 jours (72 h permettent à la plupart des vers d’atteindre le stade adulte gravide). REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster la température de croissance en fonction de la ou des souches de C. elegans utilisées.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever les vers de la plaque préparée avec du H2O distillé et les transférer dans un tube à centrifuger de 50 ml.</li>
		<li>Attendez la sédimentation des vers par gravité (environ 15 min) puis retirez le surnageant. Répétez ce processus 3 fois pour éliminer les bactéries. Après le dernier lavage, réduisez le volume à 5 ml.</li>
		<li>Ajouter 10 ml de solution de blanchiment (tableau supplémentaire 1) et agiter vigoureusement avec les mains pendant environ 6 minutes.</li>
		<li>Immédiatement après la fin de l’agitation, remplissez les tubes à une capacité de 50 ml avec un tampon M9.</li>
		<li>Centrifugez à 1400 x g pendant 3 min, retirez le surnageant jusqu’à 5 mL, puis ajoutez à nouveau 45 mL de tampon M9. Répétez ce processus 4 fois.</li>
		<li>Après le dernier lavage, réduisez le volume à 15 mL et maintenez-le à une température (20 °C) et une humidité (&gt;95 %) contrôlées pendant environ 14 h. REMARQUE : Le processus de synchronisation peut être remplacé par l’obtention d’œufs par ponte : Transférer environ 20 vers gravides adultes sur une plaque NGM (6 mm x 15 mm) préalablement ensemencée avec 200 μL d’E. coli OP50. Laissez les vers pondre des œufs pendant 1 jour. Après cela, retirez les vers enceintes et attendez que les œufs éclosent.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des vers<ol><li>À l’aide d’une pipette automatique, ajoutez 10 μL de vers synchronisés (étape 1.2.8) à une lame de microscope et comptez le nombre de vers. Calculez le volume à pipeter pour obtenir 500-1000 vers/μL.</li>
		<li>Transvaser 500 à 1000 vers synchronisés L1 (étape 1.2.8) dans des plaques de gélose NGM (150 mm x 90 mm, tableau supplémentaire 1) ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 comme source de nourriture, jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade larvaire 4 (L4) à 20 °C. REMARQUE : Les vers peuvent être transférés à l’aide d’une pipette automatique. Si vous ne disposez pas d’une pipette automatique, utilisez une pipette Pasteur en verre, et les volumes peuvent être contrôlés à l’aide d’étiquettes à microtubes ou de pipettes graduées en verre.</li>
		<li>Après 48 h de synchronisation20 : prélever les larves L4 sur les plaques avec le tampon M9 (tableau supplémentaire 1), à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique jusqu’à un tube conique propre de 50 mL et les laver 3 fois avec du tampon M9 frais ou répéter les lavages jusqu’à ce que toutes les bactéries E. coli OP50 restantes soient complètement éliminées (à température ambiante). REMARQUE : L’étape de lavage est importante car certains vers souffriront de famine pendant la procédure.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécution du test<ol><li>Transvaser 500 à 1000 vers L4 (étape 1.3.1) à partir de chacune des nouvelles plaques de gélose NGM (60 mm x 15 mm) précédemment préparées (étapes 1.1.2 et 1.1.3). Maintenez-les à 20 °C pendant 48 h jusqu’au jour du test. Ce calendrier aboutira à trois groupes expérimentaux comme suit, en double (Figure 1) : A- (famine) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM régulières sans la bactérie E. coli OP50 ; B- (régulier) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM régulières ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 ; C- (taux élevé de glucose) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 et contenant 0,025 M de D-glucose.</li>
		<li>Le jour du test (après 48 h) : récupérez les vers et faites-les passer trois brèves fois dans le tampon M9 (étapes 1.2.2 et 1.2.3) REMARQUE : Ici, préparez des plaques de gélose NGM avec l’ajout de D-glucose (étape 1.3) et mettez-les de côté jusqu’à ce qu’il soit temps d’ajouter les vers.<ol><li>Coloration à l’iode : préparer une solution d’iode de Lugol à 5 % (v/v) (solution d’iode/iodure de potassium) à l’aide d’un tampon M9 frais. REMARQUE : La solution d’iode de Lugol peut être obtenue auprès de fournisseurs de réactifs locaux ou de pharmacies, donc la concentration initiale peut varier. Si nécessaire, calculez pour obtenir une solution à 5 % (v/v).</li>
		</ol></li>
		<li>Transférez environ 100 μL de vers lavés (étape 4.2) de chaque groupe dans le microtube de 1,5 mL contenant une solution de Lugol diluée (5 % v/v). À l’aide d’une pipette automatique dans une proportion de 1:5, transférez 100 μL de vers dans 400 μL de solution de Lugol, puis agitez doucement dans un mélangeur pendant 5 min. REMARQUE : Si un mélangeur n’est pas disponible, il est possible de secouer soigneusement les microtubes à la main.</li>
		<li>Juste après ces 5 min, centrifuger le microtube de 1,5 mL (vers + solution de Lugol) à 1400 x g pendant 3 min. REMARQUE : Si ce test est effectué sur des vers de l’étage L4 ou au-delà, il est possible d’obtenir une sédimentation par gravité au lieu d’utiliser une centrifugeuse. Laissez les microtubes ouverts dans des grilles sur la paillasse pendant 10 minutes jusqu’à ce que tous les vers se soient déposés au fond du microtube.</li>
		<li>Retirez le surnageant et lavez les vers avec 1,0 mL de tampon M9 frais. Répétez le lavage jusqu’à ce que tout l’iode restant soit retiré de la solution (minimum 3x).</li>
		<li>Après la dernière étape de lavage, retirez le surnageant, à l’exception d’un résidu d’environ 100 μL. Utilisez-le pour remettre doucement les vers en suspension et pour une analyse microscopique.</li>
		<li>Transférez environ 50 μL de la solution de ver en suspension sur des lames de microscopie et couvrez-les avec des lamelles. Observez les images en fond clair à l’aide d’un stéréomicroscope (à 1,5x). REMARQUE : Si un stéréomicroscope n’est pas disponible, un microscope ordinaire peut être utilisé et les images peuvent être capturées avec l’appareil photo d’un téléphone portable (à 3,4x) à l’aide d’un adaptateur. Pour éviter les erreurs de lumière, de luminosité et d’exposition, il est essentiel que tous les paramètres de l’appareil photo du téléphone portable restent cohérents pour toutes les photos.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspection des données<ol><li>Données quantitatives : Calculez la teneur en glycogène sur la base de la coloration à l’iode des vers.<ol><li>Enregistrez les images du stéréomicroscope contenant un minimum de 10 vers par groupe dans un fichier .jpeg pour un traitement ultérieur. Pour ce faire, téléchargez le logiciel gratuit ImageJ. Les détails sont fournis dans le Fichier supplémentaire 1, la Figure supplémentaire 1, la Figure supplémentaire 2.</li>
			<li>Ouvrez l’image .jpeg à l’aide du logiciel ImageJ (qui peut être téléchargé gratuitement sur https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Cliquez sur Ligne segmentée et tracez le contour du ver (un ver à la fois). Cliquez sur Analyser, puis sélectionnez Mesurer pour obtenir la quantification de la tache. Les données seront affichées sous forme de moyenne dans le tableau. La moyenne indique les données calculées à partir de la densité de coloration par surface de ver.</li>
		</ol></li>
		<li>Données qualitatives : Obtenez des images du stéréomicroscope de chaque groupe et comparez visuellement la coloration des vers. Créez un système de notation, si nécessaire, pour analyser la coloration : 0 incolore ; 1 légèrement taché ; 2 tachés et 3 fortement tachés. À l’aide du stéréomicroscope, comptez manuellement environ 10 vers par groupe (minimum) à l’aide d’un compteur manuel.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de dosage de la teneur globale en glycogène chez C. elegans. Un schéma de l’expérience réalisée ici pour réaliser le dosage de la teneur en glycogène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Évaluation de la perméabilité intestinale
<ol><li>Préparation des vers<ol><li>Environ 14 h après la synchronisation (étape 1.2.8), transférez de 500 à 1000 vers (étape 1.3.1 et REMARQUE) au premier stade larvaire (L1) dans chaque nouvelle plaque de gélose NGM (60 mm x 15 mm) préalablement préparée et maintenez-les à 20 °C jusqu’au jour de l’essai. Ce calendrier mènera à deux groupes expérimentaux comme suit (Figure 2) : A- (jeune) : les vers vont se développer sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 jusqu’au stade larvaire 4 (L4) ; B- (vieux) : les vers vont se développer sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 jusqu’au 7ème jour de l’âge adulte. REMARQUE : Les vers maintenus jusqu’au 7e jour de l’âge adulte doivent être lavés avec un tampon M9 tous les jours et transférés dans de nouvelles plaques de gélose NGM (60 mm x 15 mm) avec 200 μL de bactéries E. coli OP50 préalablement ensemencées pour le remplacement de la nourriture et l’élimination de la progéniture. Les vers plus jeunes flottent pendant la décantation et peuvent être séparés en éliminant le surnageant. La proportion de vers schtroumpfs augmente avec l’âge. Cependant, l’évaluation de la perméabilité intestinale peut être effectuée à n’importe quel stade et à n’importe quel âge, en fonction de l’objectif de l’étude.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécution du test<ol><li>Le jour de l’essai, prélever les vers L4 (2 jours après l’étape 2.1.1) et les vers adultes le 7e jour (maintenant dans leur 9e jour) avec un tampon M9 (tableau supplémentaire 1) et transférer dans des microtubes de 1,5 ml marqués.</li>
		<li>Centrifuger à 1400 x g pendant 3 min, retirer le surnageant, ajouter 1,0 mL de M9 et mélanger délicatement. Répétez ce processus 3 fois pour éliminer les bactéries. Après le dernier lavage, réduisez le volume à 500 μL.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette automatique, ajoutez 10 μL de sédiments de vers à une lame de microscope et comptez le nombre de vers. Calculer le volume à pipeter pour obtenir 100 vers/μL.</li>
		<li>Coloration par schtroumpf : préparer une solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 % (tableau supplémentaire 1) avec de l’eau distillée. Si nécessaire, utilisez le vortex pour une meilleure solubilisation.</li>
		<li>Dans les nouveaux microtubes précédemment identifiés, à l’aide d’une pipette automatique, ajouter le volume contenant 100 vers, 100 μL de solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 %, 200 μL d’E. coli OP50 et compléter avec le tampon M9 pour un volume final de 500 μL. REMARQUE : Les volumes d’Erioglaucine disodique, d’E. coli et le nombre de vers sont fixes. Le volume du tampon M9 est variable et peut être utilisé pour porter le volume final à 500 μL.</li>
		<li>Incuber pendant 3 h avec agitation dans un mélangeur, à l’abri de la lumière, à température ambiante. REMARQUE : Si un mélangeur n’est pas disponible, secouez soigneusement les microtubes avec vos mains toutes les 15 minutes.</li>
		<li>Après 3 h, centrifuger le microtube de 1,5 mL à 1400 x g pendant 3 min. Retirer 1,0 mL de surnageant et laver les vers avec 1,0 mL de tampon M9.</li>
		<li>Répétez les lavages jusqu’à ce que la solution de sel disodique d’érioglaucine restante soit retirée de la solution. Après la dernière étape de lavage, retirez le surnageant, à l’exception d’un résidu d’environ 250 μL. Utilisez-le pour remettre soigneusement les vers en suspension et les traiter pour une analyse microscopique.</li>
		<li>Transférez environ 50 vers de la solution de vers en suspension sur des lames de microscopie et couvrez-les de lamelles. Incuber les lames de microscopie au réfrigérateur à -20 °C pendant 10 min pour paralyser les vers. REMARQUE : Une autre alternative pour paralyser les vers est d’ajouter 10 μL de solution de chlorhydrate de lévamisole (10 mM ; Tableau supplémentaire 1) et couvrez-les de lamelles.</li>
		<li>Observez et comptez le nombre total de vers et les vers totalement teints à l’aide du champ clair d’un stéréomicroscope (à 1,5x). Les images peuvent être obtenues à partir d’un appareil photo de téléphone portable (à 3,4x) couplé à un adaptateur. Pour éviter les erreurs de lumière, de luminosité et d’exposition, il est essentiel que tous les paramètres de l’appareil photo du téléphone portable restent cohérents pour toutes les photos.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspection des données<ol><li>Données qualitatives : Obtenir des images au stéréomicroscope de chaque groupe (L4 et 7e jour de l’âge adulte) et comparer visuellement la coloration des vers.</li>
		<li>Comptez le nombre total de vers et le nombre de vers schtroumpfs (vers bleus) à l’aide d’un stéréomicroscope.</li>
		<li>Exprimer les résultats en pourcentage de vers schtroumpfs en comparant les jeunes vers (L4, en groupe témoin) et les vieux vers (7e jour de l’âge adulte) : A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Où, A = nombre total de vers B= nombre de vers schtroumpfs</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma du test de perméabilité intestinale globale chez C. elegans. (A) Préparation de C. elegans. (B) Coloration au sel disodique d’érioglaucine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation du métabolisme et du vieillissement chez Caenorhabditis elegans

<ol><li>Thorp, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChatGPT+is+fun%2C+but+not+an+author%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChatGPT is fun, but not an author.</a> Science. 379 (6630), 313(2023).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C.</a> elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).</li>
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<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).</li>
<li>McGee, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+intestinal+nuclei+and+intestinal+integrity+in+aging+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C.</a> elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microtubes de 1,5 ml&nbsp ;</td><td>Fournisseurs</td> <td>locaux-Incubateur</td><td></td></tr> <tr><td>à 37 degrés</td><td>KS 4000i&nbsp ;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 mL</td><td>Fournisseurs</td> <td>locaux-Plaques</td><td></td></tr> <tr><td>de Petri de 6 cm&nbsp ;</td><td>Fournisseurs</td> <td>locaux-Agar</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>bactériologique Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (type sauvage)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, États-Unis)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose anhydre&nbsp ;</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H2O</td><td>Fournisseurs</td><td></td> locaux-Erioglaucine <td></td></tr><tr><td>sel disodique</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic Healthcare Company d’Amérique du Nord, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisole</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>solution Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Centrifugeuse 5425R Eppendorf SE, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc ; mica Qu&iacute ; mica Contempor&acirc ; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Peptone bactériologique</td><td>&ecirc ; xodo cient&iacute ; fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica S8 Apo Stereomicroscope (S&atilde ; o Paulo, Brésil)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

Le dosage de la teneur en glycogène fournit une méthode robuste et rapide pour cribler diverses conditions d’essai, telles que des études comparatives de différentes souches susceptibles d’influencer la synthèse ou la dégradation du glycogène. Dans cette étude, les vers L4 ont été soumis à trois conditions de test distinctes : le jeûne, l’alimentation et les groupes enrichis en glucose. Le test a été effectué trois fois, chaque condition étant reproduite deux fois dans chaque test ; une image représentative est illustrée à la figure 3. Après chaque essai, des vers colorés avec la solution d’iode de Lugol ont été observés à l’aide d’un stéréomicroscope, et une comparaison qualitative a été faite entre les groupes concernant la coloration des vers. En termes d’observation visuelle, les vers du groupe à jeun (famine) présentaient une coloration moins intense par rapport aux vers nourris avec E . coli OP50 (régulier), ainsi qu’à ceux nourris avec E . coli OP50 et D-glucose (glucose élevé). De plus, les vers nourris avec E. coli OP50 et D-glucose (glucose élevé) ont présenté la coloration la plus intense.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives du dosage de la teneur en glycogène. Les niveaux de glycogène chez C. elegans ont été évalués par coloration à l’iode. Les images microscopiques montrent des vers représentatifs de C. elegans soumis à (A) une famine, (B) à des conditions normales ou (C) à une glycémie élevée pendant 48 heures. Les vers ont été colorés en les immergeant dans une solution de tampon iode/M9 de Lugol (1%) pendant 5 min, en suivant la procédure détaillée à l’étape 1.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les résultats de la perméabilité intestinale montrent la différence de coloration des jeunes vers (L4) avec un intestin intact et des vers âgés (7ème jour de l’âge adulte) avec des membranes intestinales endommagées par le vieillissement (Figure 4). L’intestin de C. elegans est un tissu d’une importance capitale pour la santé, car il joue un rôle essentiel dans la digestion et le métabolisme et sert de centre de signalisation pour la réponse au stress et la régulation du vieillissement21. Chez les jeunes vers, l’intestin de C. elegans est constitué d’une barrière solide qui empêche la fuite du contenu intestinal. Cependant, à mesure que ces vers vieillissent, la fonction de barrière intestinale diminue et devient plus sensible aux perturbations dues à la dégradation progressive des cellules et des microvillosités et à l’accumulation de bactéries dans l’intestin vieillissant21,22. Lorsque les jeunes C. elegans ingèrent le colorant Erioglaucine disodium sel, l’intestin du nématode est coloré (Figure 4A). D’autre part, il est possible d’observer que les vers âgés présentaient une extravasation du colorant, imprégnant tout le corps du ver, ce qui indique une lésion de la membrane intestinale (Figure 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Figure 4 : Image représentative de la coloration de C. elegans au sel disodique d’érioglaucine. L’image microscopique montre C. elegans avec un intestin intact (stade L4) et des vers avec un intestin rompu (7e jour de l’âge adulte). Les vers ont été colorés par immersion dans une solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 % pendant 3 h, après l’étape 2.2.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Capture d’écran d’ImageJ pour sélectionner le contour de C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Capture d’écran d’ImageJ pour le calcul de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Recettes de milieux, de tampons et de culture. Composition des différents milieux, tampons et cultures utilisés dans le protocole actuel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Description détaillée du logiciel ImageJ pour la quantification de la teneur en glycogène des vers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

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Nous présentons une méthode pour visualiser les cuticules en...

Visualisation des Caenorhabditis elegans</emOuvrages cuticules> Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

Ici, nous décrivons une technique utilisée pour visualiser l’ADN génomique chez des nématodes fixes et intacts. La vidéo comprend un exemple de protocole pour compter la chromatine dans les ovocytes de C. elegans non fécondés.

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Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques.

Méthodes d'évaluation de Subcellular compartiments de muscle en C. elegans

Un guide étape par étape pour sonder la perte d’acidité lysosomale dans l’intestin c. elegans en utilisant le colorant vital sensibles au pH 6 - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescéine diacétate...

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

Nous décrivons une extraction artisanale modifiée et les dosages colorimétriques de lactate et pyruvate chez le nématode elegans de c. Lors de l’utilisation de trousses d’analyse commerciale, le développement technique de leur sensibilité et de précision est important. Précipitation de protéines dans l’extraction est l’étape la plus critique pour le dosage des métabolites intracellulaires.

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

Ce protocole décrit comment mesurer la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. Cette méthode est utile pour la recherche biologique fondamentale sur la santé intestinale liée à l'interaction entre les bactéries intestinales et leur hôte et pour le dépistage pour identifier les agents probiotiques et chimiques pour guérir le syndrome de l'intestin qui fuit et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Mesurer les effets des bactéries et des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans

Ici, une méthode est présentée pour l’analyse de la cinétique d’agrégation des protéines chez le nématode Caenorhabditis elegans. Les animaux d’une population synchronisée selon l’âge sont photographiés à différents moments, suivis d’un comptage semi-automatisé des inclusions dans CellProfiler et d’un ajustement à un modèle mathématique dans AmyloFit.

Surveillance de la cinétique d’agrégation des protéines in vivo à l’aide du comptage automatisé de l’inclusion chez Caenorhabditis elegans

Découvrez des protocoles éducatifs à faible coût pour visualiser l'accumulation de glycogène et l'intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans. Ces méthodes permettent aux étudiants d'étudier le métabolisme et le vieillissement.

Utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal

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