Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission
7 juin 2024
Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.
Nos recherches portent principalement sur l’analyse de l’ultrastructure synaptique chez les organoïdes rétiniens matures. Notre objectif est de développer une méthode de préparation d’échantillons de microscope électronique à transmission (MET) reproductible et simple pour les organoïdes rétiniens, ce qui pourrait grandement bénéficier au domaine de la recherche sur les organoïdes rétiniens. Comparé à d’autres techniques telles que le microscope optique, le microscope électronique à transmission offre la possibilité de caractériser l’ultrastructure de la synapse intégrale et les organites subcellulaires dans les organoïdes rétiniens à l’échelle nanométrique.
Notre protocole offre des conditions optimisées pour la préparation d’échantillons de microscope électronique à transmission d’organoïdes rétiniens, en renvoyant des statistiques simples et conviviales. Nos résultats montrent clairement la morphologie ultrastructurelle des synapses au sein des organoïdes rétiniens, y compris les synapses conventionnelles et les synapses en ruban. Cela établit une base solide et présente des méthodes reproductibles pour les investigations fonctionnelles ultérieures des organoïdes rétiniens, ainsi que pour l’évaluation de leurs applications cliniques telles que le criblage de médicaments.
Aperçu
Ce protocole fournit une procédure optimisée pour la préparation d'échantillons d'organoides rétiniens en microscopie électronique en transmission (TEM). L'étude se concentre sur l'analyse de l'autostructure synaptique dans les organoides rétiniens matures, offrant une méthode conviviale permettant une analyse subcellulaire détaillée au niveau nanométrique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie rétinienne
- Microscopie électronique
Contexte
- Les organoïdes rétiniens constituent des modèles précieux pour l'étude des structures et des fonctions rétiniennes.
- La microscopie électronique en transmission (MET) permet une imagerie à haute résolution des composants cellulaires.
- L'étude vise à améliorer les techniques de préparation des échantillons pour la MET afin d'obtenir une analyse détaillée.
- Les organoïdes rétiniens matures présentent des structures synaptiques qui peuvent être caractérisées à l'aide de cette méthode.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode reproductible et simple de préparation d'échantillons pour la microscopie électronique en transmission (MET) d'organoïdes rétiniens.
- Évaluer la morphologie ultrastructurale des synapses au sein de ces organoïdes.
- Jeter les bases de recherches fonctionnelles et d'applications cliniques.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'organoides rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs).
- Le protocole comprend des étapes de fixation, de coloration, de déshydratation et d'inclusion adaptées à la microscopie électronique en transmission (TEM).
- Les étapes clés incluent la coloration à l'osmium, la déshydratation par gradient et l'inclusion dans une résine époxy.
- Les observations sont réalisées à l'aide d'un microtome à coupes semi-minces et de la microscopie optique après préparation.
Résultats principaux
- La méthode met efficacement en évidence les synapses conventionnelles et en ruban dans les organoïdes rétiniens.
- Les morphologies ultrastructurales sont clairement définies, établissant ainsi une base solide pour des investigations ultérieures.
- Les résultats confirment la reproductibilité de la méthode, permettant des études fonctionnelles ultérieures.
Conclusions
- La présente étude permet une analyse détaillée des structures synaptiques au sein d'organoïdes rétiniens à l'aide de la microscopie électronique en transmission (TEM).
- La méthode de préparation optimisée facilite les recherches futures sur les organoïdes rétiniens fonctionnels.
- Les implications s'étendent à la compréhension des mécanismes neuronaux et à des applications cliniques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'analyse ultrastructurale à haute résolution des organoïdes rétiniens permet une détection mécanistique des risques et une validation des cibles au stade précoce de la découverte de médicaments ophtalmologiques. Les protocoles de préparation d'échantillons pour la microscopie électronique en transmission (MET) appliqués aux organoïdes rétiniens fournissent des données reproductibles et quantitatives sur l'architecture synaptique, renforçant ainsi la fiabilité prédictive dans des systèmes pertinents pour la maladie. Cette capacité renforce la continuité translationnelle, depuis la biologie fondamentale jusqu'à l'évaluation de modèles précliniques dans les programmes de recherche sur la rétine.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la visualisation directe de l'ultrastructure synaptique pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les synapses en ruban et les synapses conventionnelles dans les modèles d'organoïdes.
- Fournit des références morphologiques quantitatives pour la vérification d'hypothèses en biologie rétinienne.
Développement de criblages et de tests
- Établit des protocoles validés de préparation des échantillons pour des analyses d'imagerie en aval reproductibles.
- Permet une évaluation reproductible de la maturation des organoïdes et de l'intégrité synaptique.
- Facilite la standardisation de la manipulation des échantillons pour le criblage évolutif des phénotypes rétiniens.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne l'ultrastructure des organoïdes avec les caractéristiques rétiniennes humaines pertinentes pour la maladie, afin de favoriser le développement de biomarqueurs translationnels.
- Permet une continuité entre la découverte in vitro et la validation préclinique en fournissant des critères morphologiques robustes.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans le choix des modèles pour le développement de médicaments ophtalmiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de préparation des échantillons pour la microscopie électronique en transmission s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant une analyse morphologique hautement fiable d'organoides rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs).
- Biologie de la découverte : Fournit une preuve directe de la formation et de la maturation des contacts synaptiques dans les systèmes d'organoïdes.
- Écrantage : Produit des images quantitatives reproductibles permettant une analyse comparative entre différentes conditions.
- Analyse : Permet l'évaluation statistique de la morphologie et de la densité synaptiques dans des cohortes expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et les critères précliniques grâce à un alignement ultrastructural.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un protocole standardisé et reproductible, adaptable à différentes plateformes d'organoïdes rétiniens.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la modélisation des maladies rétiniennes et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation des protocoles d'imagerie ultrastructurale.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision « aller/ne pas aller » en réduisant l'incertitude mécanistique au stade précoce de la découverte.
- Impact sur le portefeuille : Permet de prioriser, en fonction du risque, les cibles et modèles rétiniens à faire progresser.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en préparation d'échantillons pour microscopie électronique en transmission et en analyse d'images subcellulaires.
- Exige un accès à des équipements spécialisés pour la fixation, l'inclusion et la microscopie.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de manipulation des échantillons et d'acquisition d'images.
- Peut être adapté à divers systèmes d'organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites moyennant une optimisation du protocole.
- Dépend du contrôle qualité des réactifs et des matériaux d'inclusion pour assurer la reproductibilité.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
1:38
Retinal Organoid Fixation and Post Fixation Procedure for TEM Sample Preparation
2:39
Staining, Dewatering, and Infiltration of Fixed Retinal Organoids for TEM Sample Preparation
4:24
Retinal Organoid Embedding and Semi‐Thin Slice Positioning for Transmission Electron Microscopy
