Name: In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-11T17:30:00.000+00:00
Duration: 25 min 26 s
Description: Découvrez la culture organotypique de rétines entières murines pour la biologie rétinienne. Cette méthode préserve les interactions neuronales et facilite l'accessibilité expérimentale des tissus rétiniens in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier E. de la Rosa et AI Valenciano de l&#39;aide initiale avec la mise en place des cultures organotypiques et U. Laub et U. Gerster d&#39;assistance technique.

Tout le matériel et les réactifs doivent être achetés stérile ou doit être la chaleur ou stérilisé à la vapeur ou stérilisé avec de l'EtOH 70%. Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes la directive du Conseil (86/609/CEE), suivant les directives du NIH concernant les soins et l'utilisation d'animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le comité institutionnel soin et l'utilisation comité (IACUC) à l'Université de Duisburg-Essen (Allemagne). Partie 1: énucléation des yeux murins de différents stades de développement Énucléation des yeux embryonnaire <ol><li> Accouplements Temps enceintes sont mis en place et le matin du jour où un bouchon vaginal est détecté dans l'accouplement des femelles est désigné 0 jours de gestation. </li><li> La femme enceinte est sacrifiée par dislocation cervicale lorsque le développement de l'embryon a atteint le stade désiré (ici: jour embryonnaire (E) 15) et fixé sur une cire conseil 6. </li><li> La paroi abdominale est humidifiée avec de l'EtOH 70%, couper le long de la ligne médiane et les lambeaux cutanés sont fixés latéralement par les broches 6. </li><li> Le uterusses sont retirés de l'abdomen, détaché et transféré dans un bécher avec du PBS froid 6. </li><li> Les embryons sont séparés, transféré à une boîte de Pétri et paroi de l'utérus et les membranes embryonnaires sont retirés avec soin par l'utilisation de forceps 6. </li><li> Les embryons sont tués par décapitation. </li><li> Les yeux sont énucléés être l'utilisation de fines pinces courbes, "éplucher" les yeux de l'orbite de l'œil. </li></ol> Énucléation des yeux postnatale et adulte <ol start="1" type="1"><li> Jeunes chiots sont tués par décapitation, les chiots plus âgés et les adultes par dislocation cervicale. </li><li> Jusqu'à l'étape postnatale P15, le point de temps où les souris ouvrent leurs yeux, des fentes oculaires doivent être mécaniquement ouverte par l'utilisation de forceps et agrandi par deux coupes transversales des paupières avec des ciseaux à ressort. </li><li> Les yeux sont énucléés à l'aide de forceps courbés, appliquant une pression sur l'orbite. </li></ol> Remarque: Comme au jour postnatal 2, les os orbital sont encore cartilagineux, il est important de ne pas appliquer trop de pression tout en essayant d'enlever les yeux. En revanche, chez les souris adultes, l'os orbital sont fermes. Ainsi, afin d'énucléer les yeux, il suffit d'appliquer une pression sur l'orbite sans agrandir les fentes oculaires à l'avance. Partie 2: Dissection de l'embryon, postnatale et adulte rétines murin Dissection de la rétine <ol><li> Les yeux sont placés dans une petite boîte de Petri avec du PBS stérile et les couches entourant l'œil sont éliminés sous un microscope à dissection. </li><li> Pour enlever les couches externe de l'œil, dans les étapes post-natale et des yeux d'adulte le nerf optique doit être coupé à l'aide de ciseaux printemps ou pincé par forceps que près de la base que possible. </li><li> Tournez les yeux, de sorte que la face arrière avec le trou où le nerf optique à l'origine résidait est face à vous. Entrez l'espace sous-rétinien, entre la rétine et l'épithélium pigmentaire avec les bouts des deux pinces très fines sur le site où le nerf optique pénétré les couches les yeux. Remarque: Habituellement, l'épithélium pigmentaire peut être facilement identifié par sa couleur foncée. Dans certaines souches de souris mutantes - en particulier dans les animaux albinos - cette couche pigmentaire peut toutefois ne pas être de couleur et ne peuvent donc être facilement à détecter. </li><li> Retirer l'épithélium pigmentaire avec la choroïde et la sclère attachée par déchirer soigneusement de chaque côté à la fois avec une pince. </li><li> Décollez les couches au niveau de la cornée, puis tournez la tasse de l'œil vers l'objectif et de supprimer la cornée avec l'épithélium pigmentaire, choroïde et la sclère, tout en retenant la tasse restante de la rétine par la pince d'autres. </li><li> Saisir le vitré avec la petite lentille et tout déchirer avec une pince, garder le wholemount rétine en place avec la seconde pince. Remarque: Lors de la dissection yeux embryonnaire, assurez-vous d'enlever complètement la forme triangulaire, en forme de tente plexus capillaire sous le corps vitré en collaboration avec le corps vitré. Dans l'œil adulte, le corps vitré doit être saisie sur les côtés et le soin doit être pris pour ne pas percer le corps vitré avec les pointes de la pince que son contenu est visqueux et adhère à la pince, ce qui entrave son enlèvement. </li><li> Pour la culture organotypique wholemount les coupes rétiniennes sont recueillies dans une plaque de 96 puits contenant 200 pl de milieu Eagle modifié par Dulbecco (voir ci-dessous). </li></ol> Note: Entre la dissection des rétines individuels, garder la plaque de collecte de 96 puits contenant le milieu de culture dans l'incubateur que le pH du milieu de culture est déclenchée par le CO 2 via le système carbonate. Partie 3: murins wholemount organotypiques rétiniennesla culture <ol><li> Préparez 500 ml de culture par des moyens de pondération 7,8 g de Dulbecco modifié Eagle / mélange nutritif F-12 HAM (DMEM) et 0,6 g de NaHCO 3 et de dissoudre la fois dans l'eau MiIliQ. Ajuster le pH à 7,15. Ajouter 50mg apo-transferrine, 50 pl putrescine (stock: 60mg/ml), 50 pl de sodium sélénite (stock: 52μg/ml), la progestérone (stock: 60μg/ml), et 2,5 ml gentamicine (200 mm) sous le capot. Mélanger et filtrer à travers un filtre bouchon de bouteille. Immédiatement avant l'utilisation de la glutamine ajouter 10 ul (200 mm) par un milieu de culture ml. Note: Ce milieu sans sérum et sans insuline peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2 semaines et utilisé pour des expériences induction de l'apoptose que l'insuline ne contrecarre les effets. Si l'incubation des échantillons entiers pendant plus de 24h est désirée et les taux de mort cellulaire ne seront pas évalués, le taux sérique d'insuline (par exemple sérum de veau foetal; FCS) ou les suppléments doivent être ajoutés pour améliorer les taux de survie. </li><li> Avant de commencer la culture, les échantillons entiers rétiniens sont pré-incubées pendant 15 min à 37 ° C avec 200 pi au chaud, au pH équilibré DMEM contenant hyaluronidase 0.5mg/ml de pré-digérer les hyaluronidase contenant intérieur et extérieur de la membrane limitante M ller glie cellules, facilitant la pénétration des substances appliquées de manière exogène. </li><li> Rétines sont transférés à une plaque de 24 puits avec comme hyaluronidase peu que possible et cultivée que dans les échantillons entiers organotypiques 2ml milieu chimiquement défini Eagle modifié par Dulbecco. Remarque: Pour transférer les rétines, l'utilisation d'une pipette de 1 ml et couper l'extrémité de la pipette quelques millimètres à élargir l'ouverture. Pour les yeux embryonnaire, une astuce 200 pipettes ul est suffisante. Les arêtes de coupe doivent être blanchis par l'insertion et la torsion d'une seconde extrémité de la pipette. Pour 24-48 heures court terme les cultures, toutes les étapes peuvent être réalisées sur le banc, mais si la contamination des cultures se révèle être un problème, on doit travailler sous le capot. </li><li> Les cultures sont maintenues pendant 24 - 48 h à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 par exemple, 5% et soumis à un traitement pharmacologique avec des facteurs recombinants. </li></ol> Partie 4: Dissociation des échantillons entiers cultivés rétiniennes <ol><li> Après le temps de culture souhaitée, rétines sont collectés dans des tubes Eppendorf 2 ml à fond rond contenant 850 ul de PBS et 50 ul d'albumine sérique bovine (BSA; 30 mg / ml). </li><li> Placer les tubes Eppendorf avec rétines dans un bloc de chauffage, chauffer à 37 ° C. </li><li> Ajouter 25 ul de la collagénase (200 U / ml) et 25 ul hyaluronidase (20mg/ml) dans chaque tube Eppendorf et commencer à dissocier les rétines en suspension seule cellule par 3 passe à travers une pipette Pasteur siliconée. </li><li> Ajouter 10 ul de trypsine (1mg/ml), attendre 3-5 minutes, puis lentement la pipette 3-5 fois monter et descendre avec une pipette Pasteur siliconée mécaniquement dissocient le tissu. </li><li> Ajouter 10 ul de DNase I (5mg/ml), encore une fois d'attendre pendant 3-5 min, puis lentement la pipette 3-5 fois monter et descendre avec siliconé pipette Pasteur. Remarque: Le temps d'incubation de la dissociation enzymatique varie et dépend de la taille des yeux et du stade de développement, respectivement. Vérifiez la phase de digestion enzymatique du tissu par un léger pipetage de haut en bas. </li><li> Si la suspension de cellules n'est pas homogène maintenant mais contient encore des agrégats de cellules grandes, ajoutez supplémentaire de 10 trypsine ul et 10 ul de DNase I. </li><li> Lorsque la suspension cellulaire est homogène, la digestion du tissu est arrêtée par addition de 10 ul d'EDTA (0,5 M), des tubes Eppendorf sont retirés du radiateur et les suspensions cellulaires sont fixés pour 1h par addition de 1ml frais, glaces paraformaldéhyde 8% à froid (PFA) à température ambiante sur un agitateur de rotation. </li></ol> Partie 5: Lavage des suspensions de cellules dissociées <ol><li> La suspension cellulaire est centrifugée 5 min à 4 ° C et à 0,2 fcr dans une centrifugeuse de refroidissement. </li><li> Le surnageant est écarté et le culot est remis en suspension dans 1ml de PBS contenant de la BSA 3mg/ml. </li><li> Après avoir répété ces étapes deux lavages, le culot est finalement remis en suspension dans 500 ul de PBS contenant de la BSA 3mg/ml, 5mM EDTA et de l'azide de sodium à 0,1%. </li></ol> Remarque: L'addition d'acide de sodium permettent le stockage de la suspension cellulaire pendant plusieurs jours à 4 ° C. Toutefois, si un marquage immunocytochimique suivront, ne pas ajouter d'acide de sodium dans le tampon de resuspension, car cela entraîne une perte de qualité de la coloration. Partie 6: Cytospin des suspensions cellulaires de l'apoptose et l'analyse quantitative de prolifération <ol><li> Une lame de microscope dépolies-end, un filtre cytospin avec un ou deux trous et d'un entonnoir cytospin sont insérés dans un clip glisser cytospin. Le clip clapet coulissant est fermé et placé dans le rotor cytospin. </li><li> La suspension de cellules dissociées est homogénéisé par pipetage doucement de haut en bas. Remarque: Selon le stade de développement de la rétine, la suspension cellulaire de la procédure de dissociation peut être nécessaire deêtre diluée avec du PBS pour obtenir un nombre fini de cellules. </li><li> Une aliquote (100 pi) de la suspension cellulaire est appliqué à un entonnoir cytospin. Remarque: Lorsque le pipetage de la suspension cellulaire à l'entonnoir, l'extrémité de la pipette devrait atteindre tout le chemin vers le fond de l'entonnoir. Il est important de ne pas pousser à travers le deuxième point de poussée de la pipette car cela crée des bulles d'air, qui sera visible dans la tache de cellules après la cytospin et entrave comptages cellulaires. </li><li> La suspension cellulaire est déposée sur une lame à 700 rpm pendant 7 min. </li><li> Pour la détermination de l'effet de facteurs exogènes appliqués sur les niveaux apoptose des cellules peut être teinté avec 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 2μg/ml), monté avec fluorescentes milieu de montage. Les changements dans l'apoptose des cellules peut être déterminé en comptant au moins 1000 cellules (comprenant au moins 10 noyaux pycnotiques) dans les spots de cellules cytospin et le taux de mort cellulaire est calculée en pourcentage du nombre total de cellules compte 3,4. Note: Alternativement, la répartition des noyaux apoptotiques peuvent être évalués dans flatmounts 3 ou cryostat sections4 des échantillons entiers de culture de la rétine par la TdT médiée étiquetage dUTP Nick fin (TUNEL). </li><li> Pour la détection de la prolifération cellulaire, BrdU (5 uM) peuvent être ajoutés 6h avant la fin de la culture et l'incorporation de BrdU visualisées dans cytospins d'homogénats de cellules par coloration immunocytochimique utilisant un anticorps anti-BrdU (par exemple les études de développement de la Banque d'hybridome, Iowa, USA). </li><li> L'effet du traitement sur les différents types de cellules rétiniennes peuvent être visualisées dans cytospins par les anticorps spécifiques comme Brn3a neurone (marqueur des cellules ganglionnaires) ou opsine (photorécepteur marqueur) et une contre-coloration au DAPI. </li></ol> Partie 7: Résultats Représentant <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Étapes de préparation des échantillons entiers murin organotypiques rétiniennes Un chef de la souris avec les deux yeux. B murins avec des yeux jusqu'à côté de l'objectif, toutes les couches encore en place. Oculaire C murin de l'arrière avec le nerf optique encore attaché. D oeil murins avec la sclère et l'épithélium pigmentaire partiellement enlevé. E rétine murine avec l'épithélium cornée, la sclère et pigment complètement enlevée, mais l'objectif et vitreux toujours en place. F murin tasse de rétine wholemount avec lentille et vitreux enlevé. S'il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Analyse des cultures organotypiques rétine wholemount par cytospin et les sections Pour l'analyse de l'apoptose, cytospins de suspensions cellulaires dissociées sont colorés par le DAPI et des noyaux pycnotiques peuvent être distingués par la fragmentation nucléaire ou condensation de la chromatine (pointes de flèches en A). Alternativement, les articles wholemount (CE; jour rétine murin postnatal (P) 2) ou flatmount rétiniennes (F) peut être soumis à un essai TUNEL et contre-colorées avec du DAPI (E). L'effet du traitement sur ​​les différents types de cellules rétiniennes peuvent être visualisées dans cytospins par les anticorps spécifiques des neurones comme le marqueur de cellules ganglionnaires Brn3a (flèches en B) GCL, couche des cellules ganglionnaires;. INL, prospective couche nucléaire interne. S'il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol><li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free%2C+bioreactor-based+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li>
<li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li>
<li>de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+How+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
</ol>

L&#39;avantage de 2-5 murin organotypiques rétine cultures wholemount plus de dissociation, monocouche, retinospheroid ou ré-agrégées 3D cultures sphéroïde 1 réside dans la préservation des interactions neuronales et de connexions, imitant la situation in vivo. En comparaison avec les anciens rapports 2, notre article vidéo fournit une démonstration détaillée des particularités de l&#39;énucléation des yeux murin et la dissection des rétines de différents stades de déve...

<table><tbody><tr><td>Souris</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Outil</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Le PBS doit être froid (&amp;gt; 4&amp;#x00B0;C) et stérile</td></tr><tr><td>Milieu de culture modifié d'Eagle de Dulbecco / mélange nutritif F-12 de Ham</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 8900</td><td>DMEM / F-12</td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 5780</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 9133</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 6149</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>200 mM (100X), liquide</td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin (BSA)</td><td>Réactif</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8076.3</td><td>30 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C 0773</td><td>200 U/ml</td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td>Issue du pancréas porcin ; 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 3884</td><td>200 mg/ml</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Réactif</td><td>Roche Group</td><td>1 284 932</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 6511</td><td></td></tr><tr><td>Solution de silicone</td><td>Réactif</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>35130</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>8 % de PFA dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4).</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 0542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Milieu de montage fluorescent</td><td>Réactif</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>BrDU</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 9285</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 96 puits</td><td>Outil</td><td>Falcon BD</td><td>3072</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Outil</td><td>Falcon BD</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td>Outil</td><td>Brand GmbH</td><td>747720</td><td></td></tr><tr><td>Pinces DUMONT n°5</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>becs très fins biseautés (extrémité 0,05 mm x 0,02 mm)</td></tr><tr><td>Pinces DUMONT n°7</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>becs courbés (extrémité 0,07 mm x 0,10 mm)</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort, droits, 8 cm</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>petites lames droites fines</td></tr><tr><td>Ciseaux standards, droits, pointus/émoussés</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>À utiliser pour la décapitation ou la dislocation cervicale</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>2 ml ; fond rond pour une meilleure précipitation du culot lors de la centrifugation / cytospin</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif</td><td>Outil</td><td>CAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Outil</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo-like organotypiques culture wholemount murin rétiniennes

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Ablations ciblées de gènes et l&#39;analyse des modèles animaux est la stratégie classique pour s&#39;inscrire fonction spécifique du gène de la rétine. Toutefois, transgéniques, la rétine spécifiques ou conditionnelle des modèles de souris KO présentent souvent létalité précoce ou qui souffrent de malformations graves, empêchant une analyse au-delà embryonnaire ou postnatale premiers stades. Culture de cellules primaires est une alternative à étudier les effets de facteurs exogènes appliqués recombinante, la surexpression de gènes ou de siRNA inactivation génique à médiation dans un environnement contrôlé. Culture de cellules dissociées a l&#39;avantage que les signaux endogènes atteindre les cellules cibles sont réduites, facilitant ainsi l&#39;identification des effets exogènes déclenché après la manipulation pharmacologique. Toutefois, d&#39;importantes interactions entre cellules sont initialement détruits par la digestion enzymatique ou de dissociation mécanique, même si réagrégées cultures retinospheroid 1 sont utilisées. En revanche, les cultures organotypiques rétine wholemount fournir un système proche de la situation in vivo physiologiques avec des interactions neuronales et de connexions 2-5 encore préservée. Dans cet article nous proposons une vidéo démonstration étape par étape (1) de l&#39;établissement d&#39;in vivo-rétinienne, comme organotypiques cultures wholemount notamment particularités dissection de l&#39;embryon, postnatale et adulte yeux murin et (2) une procédure de dissociation et cytospin pour l&#39;analyse des neurones l&#39;apoptose et la prolifération des cellules rétiniennes chez échantillons entiers organotypiques, par exemple après la culture, en présence de facteurs exogène appliquée recombinantes.

Cet article vidéo démontre la mise en place de cultures organotypiques rétine wholemount et une procédure d&#39;analyse des cytospin effets induits de manière exogène. Organotypiques rétine cultures wholemount imiter la<em&gt; In vivo</em&gt; La situation et faciliter considérablement l&#39;accessibilité des rétines de souris pour les manipulations expérimentales en contournant les inconvénients de modèles animaux murins classiques.

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

L'ablation ciblée de gènes et l'analyse de modèles animaux constituent la stratégie classique pour déterminer la fonction de gènes rétiniens spécifiques. Cependant, les modèles transgéniques, ...

Bonjour, je m'appelle Nicole Dunca. Je suis chef du Département de neurologie de l'Institut d'anatomie de l'Université de D book ASIN en Allemagne. Bonjour, je suis étudiante au doctorat dans le laboratoire de la Professeure Dunca au Département de neuroanatomie.Aujourd'hui, nous allons vous présenter un système pratique de culture de rétines neurosensorielles proche de la situation in vivo sous forme d'organocultures de rétines. Commençons donc. L'ablacion ciblée de gènes et l'analyse de modèles animaux constituent une stratégie classique pour déterminer la fonction spécifique des gènes rétiniens.Cependant, les modèles de souris transgéniques présentent souvent une lithogenèse précoce ou souffrent de malformations sévères empêchant une analyse au-delà des stades embryonnaires ou postnataux précoces. La culture cellulaire primaire constitue une alternative pour étudier les effets de facteurs recombinants appliqués de façon exogène dans un environnement contrôlé. La culture de cellules dissociées présente l'avantage de réduire les signaux endogènes atteignant les cellules cibles, facilitant ainsi l'identification des effets induits de manière exogène.Cependant, les interactions cell

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Cet article montre la dissection et l'incubation de la rétine de lapin et médiation par des particules de transfert de gènes de plasmides codant pour la GFP ou une variété de marqueurs subcellulaires dans les cellules ganglionnaires de la rétine.

Culture organotypique de Retina lapin adulte

Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte pour sept jours. En bref, un papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale décollé de l'EPR et le côté photorécepteur lieu sur un insert soulevées par un stand sur mesure.

Culture organotypique de pleine épaisseur Retina porcin adultes

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Le protocole décrit des explants organotypiques de la neurorétinede souris, cultivés avec son épithélium pigmentaire rétinien (RPE), en milieu défini R16, exempt de sérum et d’antibiotiques. Cette méthode est relativement simple à réaliser, moins coûteuse et prend beaucoup de temps par rapport aux expériences in vivo, et peut être adaptée à de nombreuses applications expérimentales.

Culture à long terme et sans sérum d’explants organotypiques de la rétine de souris avec un épithélium pigmentaire rétinien intact

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Cette étude vise à développer un nouveau modèle de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) qui empêche de compromettre l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des explants. Ceci est réalisé en cultivant la rétine avec le vitré sous-jacent et le pigment rétinien sous-jacent épithélium-choroïde (RPE-choroïde) et la sclérotique.

Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

Ce protocole présente et décrit les étapes pour l’isolement, la dissection, la culture et la coloration des explants rétiniens obtenus à partir d’une souris adulte. Cette méthode est bénéfique comme modèle ex vivo pour étudier différentes maladies neurovasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Explant rétinien de la rétine de souris adulte comme modèle ex vivo pour l’étude des maladies neurovasculaires rétiniennes

Des explants rétiniens obtenus à partir de macaques de type sauvage ont été cultivés in vitro. La dégénérescence rétinienne et la voie de signalisation cGMP-PKG ont été induites à l’aide de l’inhibiteur de la PDE6 zaprinast. L’accumulation de GMPc dans les explants à différentes concentrations de zaprinast a été vérifiée par immunofluorescence.

Cultures organotypiques d’explants rétiniens de singe macaque

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler la rétine de l’œil de la souris pour une expérimentation ex vivo étendue. Ce protocole vise à rendre cette approche techniquement exigeante accessible aux chercheurs qui souhaitent tirer parti des avenues de recherche offertes par le maintien de la glie rétinienne in situ dans les tissus vivants.

Un modèle d’explant ex vivo pour étudier les interactions gliales dans la rétine de la souris

Découvrez la culture organotypique de rétines entières murines pour la biologie rétinienne. Cette méthode préserve les interactions neuronales et facilite l'accessibilité expérimentale des tissus rétiniens in vivo.

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

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