In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Bonjour, je m’appelle Nicole Dunca. Je suis chef du département de neurologie à l’Institut d’anatomie de l’Université de D book ASIN en Allemagne. Bonjour, je suis étudiante au doctorat au laboratoire du professeur Dunca au Département de neuroanatomie.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer un système pratique pour cultiver des neurorétines proches de la situation NI en tant qu’hormones rétiniennes organotypiques. Alors commençons. L’ablation ciblée de gènes et l’analyse de modèles animaux sont une stratégie classique pour enrôler une fonction génique rétinienne spécifique.

Cependant, les modèles de souris transgéniques présentent souvent une lithologie précoce ou souffrent de malformations sévères empêchant une analyse au-delà des stades embryonnaires ou postnatals précoces. La culture cellulaire primaire est une alternative pour étudier les effets des facteurs recombinants appliqués de manière exogène dans un environnement contrôlé. La culture cellulaire dissociée présente l’avantage de réduire les signaux endogènes atteignant les cellules cibles, facilitant ainsi l’identification des effets déclenchés de manière exogène.

Cependant, d’importantes interactions cellulaires sont détruites dans les cultures dissociées. En revanche, les cultures d’hormones rétiniennes organotypiques fournissent un système proche de la situation physiologique in vivo avec des interactions et des connexions neuronales toujours préservées. Dans notre article vidéo, nous fournissons une démonstration étape par étape de la micro dissection des yeux morins, y compris l’ablation du cristallin et du vitré.

Après que la souris de 15 jours Emyo a été tuée par décapitation. Les yeux sont nucléés à l’aide de fines pinces incurvées, en pelant la glace de l’orbite. Deux jours après la naissance, les jeunes bébés souris sont tués par décapitation jusqu’à la période postnatale.

Le 15e jour, le moment où les souris ouvrent les yeux, les isolats doivent être ouverts mécaniquement à l’aide de pinces. La pointe d’une pince à courbe fine est insérée dans l’orbite et le tissu conjonctif entourant l’œil est retiré. Comme au deuxième jour postnatal, les os orbitaires sont encore cartilagineux et mous.

Il est important de ne pas appliquer trop de pression avec la pince tout en essayant d’enlever les yeux. Les bébés souris de 15 jours sont tués par une luxation cervicale. Ensuite, les isolats sont agrandis par deux transferts, coupes aux ciseaux à ressort.

Ensuite, les yeux sont nucléés à l’aide de pinces incurvées, appliquant une pression sur l’orbite et transférés dans une boîte de Pétri. Avec le PBS, les souris adultes sont tuées par la luxation cervicale et les yeux peuvent être directement nucléés à l’aide de pinces incurvées appliquant une pression sur l’orbite. Nous allons démontrer les particularités de cette section des yeux morins de différents stades de développement de l’œil morine gauche à l’œil morine droit au 15e jour embryonnaire, au deuxième jour postnatal, au 15e jour postnatal et à un œil adulte dans une petite boîte de Pétri.

Avec le PBS stérile, les couches oculaires environnantes doivent être retirées pendant la dissection, les deux avant-bras doivent reposer sur le plan de travail. Pour stabiliser les mains, l’œil est tourné avec le site du cristallin face au bas de la boîte de Pétri. Lors de la dissection des yeux embryonnaires, le site où le nerf optique en développement soulage l’œil est souvent recouvert de tissu conjonctif, qui doit être retiré pour créer un espace permettant d’entrer dans l’espace sous-rétinien entre la rétine et l’épithélium pigmentaire à l’aide des pointes de pinces très fines, la sclérotique et l’épithélium pigmentaire sont encore très mous et faciles à enlever.

Assurez-vous cependant d’enlever complètement le plexus capillaire triangulaire de Trent sous le corps vitré, ainsi que le vitré. Ce plexus collant est difficile à enlever séparément de la coupe rétinienne restante sans endommager la rétine, mais il entravera l’excès de substances exogènes appliquées sur les couches rétiniennes. Au cours des manipulations pharmacologiques au deuxième jour postnatal, le nerf optique à l’arrière de l’œil doit être pincé par des forceps.

Les couches oculaires environnantes, y compris la sclérotique et l’épithélium pigmentaire, sont encore molles et faciles à enlever. Attention toutefois à ne pas endommager la rétine. Lors de l’entrée dans l’espace sous-rétinien par le trou du nerf optique, l’épithélium pigmentaire est retiré avec la membrane choroïde et la sclérotique en déchirant soigneusement de chaque côté avec les deux pinces.

L’œilleton est ensuite tourné vers le côté de la lentille, la lentille et le vitré sont saisis à l’aide d’une pince. Et pendant qu’il se déchire, l’œilleton maintient Place avec l’autre pince. Au 15e jour postnatal, le nerf optique reste souvent attaché à l’œil lors d’une nucléation et doit être pincé par des forceps aussi près que possible de la base.

La sclérotique est déjà plus serrée et pénètre ainsi dans l’espace sous-rétinien. Au trou où le nerf optique a été enlevé et où la desquamation de la membrane choroïde de la sclérotique et de l’épithélium pigmentaire devient plus difficile qu’à P deux. Décollez les couches jusqu’au niveau de la cornée, puis tournez l’œilleton vers le site du cristallin et retirez la cornée ainsi que le pigment, l’épithélium, la membrane choroïde et la sclérotique.

Tout en tenant la cupule rétinienne restante à l’aide de l’autre pince, saisissez le vitré avec le petit cristallin et, tout en déchirant avec une pince, maintenez le support d’hormone rétinienne en place avec l’autre pince dans l’œil adulte. Le nerf optique, qui doit être pincé pour accéder à l’espace sous-rétinien, est beaucoup plus épais que les stades postnatals. Le plus clair est extrêmement ferme et la pénétration avec des pinces pour pénétrer dans l’espace sous-rétinien se révélera être une partie difficile de la dissection, arrachant l’épithélium pigmentaire avec la membrane actuelle et la sclérotique devient plus dure et nécessite plus de force contrôlée.

L’ablation du vitré est beaucoup plus facile que celle des yeux embryonnaires, mais le vitré doit être saisi sur les côtés. Ne percez pas le vitré avec les pointes de la pince car son contenu collera à la pince, ce qui entravera son retrait. Avant de commencer la culture, la hyaluronidase contenant la membrane interne et auto-limitante des cellules gliales doit être partiellement digérée pour faciliter la pénétration des substances exogènes appliquées à cet effet, tuyau H 200 microlitre pH équilibre, ous aigles modifiés milieu contenant 0,5 milligramme par millilitre hyaluronidase dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour transférer le monticule rétinien domestique sans dommage.

La pointe d’une pipette d’un millilitre est coupée de quelques millimètres pour élargir l’ouverture et les bords de coupe sont lissés par insertion et torsion d’une deuxième pointe de pipette. Les hormones de la rétine sont transférées de la plaque de collecte de 96 puits à la plaque de 96 puits contenant un milieu avec des jours élevés et pré-incubées pendant 15 minutes à 37 degrés centigrades. Ensuite, les hormones sont transférées dans une plaque de 24 puits contenant deux millilitres chimiquement définis en BECUs modifiés Eagles.

Moyen Par puits. Les cultures d’hormone rétinienne sont renvoyées dans un incubateur et maintenues pendant 24 à 48 heures à 37 degrés centigrades dans une atmosphère à 5 % de CO2, 850 microlitres de PBS et 50 microlitres de bovin zéro album. Les miens sont pipetés à des tubes de deux millilitres d’eph à fond rond.

L’utilisation de tubes eph à fond rond au lieu des tubes chroniques classiques a amélioré la précipitation des cellules pendant la centrifugation, ce qui a entraîné une palette cellulaire plus stable. Après le temps de culture souhaité, les mos rétiniens à domicile sont transférés de la plaque de 24 puits aux tubes de deux millilitres contenant du PBS et de l’album X bovin Mine. Les tubes eph contenant le mos rétinien domestique sont placés dans un bloc chauffant chauffé à 37 degrés centigrades, 25 microlitres de collagénase et 25 microlitres.

Des jours hyaluroniques sont ajoutés à chaque cube eph et la dissociation des hormones rétiniennes en suspension unicellulaire est déclenchée par trois pars à travers des pipettes Poster siliconées. 10 microlitres de trypsine sont ajoutés et la suspension cellulaire incubée pendant trois à cinq minutes. Le temps d’incubation de la dissociation des zymes varie et dépend respectivement de la taille des yeux et du stade de développement.

Vérifiez l’étape de la digestion enzymatique du tissu en pipetant doucement de haut en bas Après quelques minutes, 10 microlitres d’ADN sont modifiés après une autre période d’incubation d’environ trois à cinq minutes. La suspension cellulaire est encore homogénéisée en pipetant lentement vers le haut et vers le bas. Lorsque la suspension cellulaire apparaît homogène, la digestion du tissu est arrêtée par l’ajout de 10 microlitres d’EDTA et les tubes d’eau sont retirés du chauffage.

Un millilitre de glace fraîche 8 % Perfomal Hyde est ajoutée à chaque tube EOL et les suspensions cellulaires sont fixées à température ambiante sur un agitateur rotatif. Après une heure de fixation, les suspensions cellulaires sont retirées de l’agitateur de rotation et placées dans une centrifugeuse de refroidissement. Les suspensions cellulaires sont centrifugeuses pendant cinq minutes à 40 degrés centigrades et à une force relative et ougale de 0,2, la suspension cellulaire palliative est retirée de la centrifugeuse.

Le SUP natant est jeté et le pâté est remis en suspension dans un millilitre. PBS contenant trois milligrammes par millilitre BSA. Après avoir répété deux fois ces étapes de lavage, le granulé est finalement remis en suspension dans 500 microlitres.

PBS contenant trois milligrammes par millilitre. BSA EDTA cinq millimolaires et 0,1 % d’acide de sodium si une coloration immunochimique s’ensuit, n’ajoutez pas d’acide de sodium au tampon de suspension Resus. Et cela entraîne une perte de qualité de coloration.

Une lame de microscope à extrémité givrée, un filtre à cytosine avec un ou deux trous et une rangée d’entonnoir à cytosine insérée dans un clip de cytosine Et le léger clip est fermé. Assurez-vous que les trous de l’entonnoir et du filtre à cytosine sont alignés. Tous les clips de lame sont placés dans le centre de cytosine.

Le futur rotor homogénéisé est la suspension cellulaire associée par pipetage doux vers le haut et vers le bas. Lors du pipetage d’un Equa de 100 microlitres de suspension cellulaire dans l’entonnoir, la pointe de la pipette doit descendre jusqu’au fond de l’entonnoir. Il est important de ne pas pousser à travers le deuxième point de pression de la pipette.

Si cela crée des bulles d’air dans la cellule, ce qui entravera le comptage des cellules, le couvercle est placé sur le rotor et le rotor est soulevé dans la centrifugeuse. Les suspensions à cellule unique sont centrifugées à 700 tr/min pendant sept minutes. Le rotor est retiré de la cytosine et le couvercle est ouvert.

Le clip latéral est ouvert et l’entonnoir et le clip de glissière sont retirés. Ensuite, le point de voile est marqué par un ajout au dos de la glissière. Alors que le filtre est encore en place, le filtre est retiré et la glissière avec un point de voile est une lamelle avec darie dans le support de montage.

Alternativement, la tache cellulaire peut être immunochimiquement colorée avec BREU ou des anticorps neurospécifiques. Nous venons de démontrer les avantages des hormones rétiniennes organotypiques fournissant un système de culture proche de la situation physiologique in vivo avec des interactions et des connexions neuronales toujours préservées. Ce système de culture facilite considérablement l’accessibilité pour les manipulations des yeux morins.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.