Name: Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction d'ADN de faible poids moléculaire à partir d'eaux usées pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementale. Cette technique permet de capturer les gènes de résistance génomiques et transférés horizontalement.

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Nous reconnaissons le soutien financier de la Fondation Rockefeller (numéro de subvention de la Fondation Rockefeller 2021 HTH 018) dans le cadre de l’équipe APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Nous reconnaissons également l’aide financière fournie par Axis Bank pour soutenir cette recherche et par la Trivedi School of Biosciences de l’Université Ashoka pour l’équipement et d’autres soutiens.

1. Échantillonnage des eaux usées
<ol><li>Trempez un bécher en polypropylène de 500 mL dans le drain à ciel ouvert ou le réservoir de la station d’épuration des eaux usées (STP) et prélevez ~300 mL d’échantillon d’eaux usées.</li>
	<li>Transférez ~250 ml de l’échantillon dans une bouteille en polypropylène autoclavée de 250 ml.</li>
	<li>Vissez le bouchon de la bouteille et fermez-le avec un film plastique. Gardez la bouteille à la verticale dans un sac fermé.</li>
	<li>Transportez l’échantillon à la verticale dans un récipient fermé à température ambiante.</li>
	<li>Inactiver thermiquement l’échantillon à 70 °C dans un four à air chaud pendant 4 h avant de le traiter pour l’extraction de l’ADN.</li>
</ol>2. Extraction d’ADN à partir d’échantillons d’eaux usées
<ol><li>Une fois l’échantillon d’eaux usées refroidi, vortex les échantillons à la vitesse maximale et laissez les débris/boues se déposer.</li>
	<li>Décanter 27,5 ml des eaux usées dans des tubes à centrifuger de 50 ml et y ajouter 13,5 g de PEG-8000 (concentration finale 30%) et 3 g de NaCl (concentration finale 1,2 M) et bien mélanger jusqu’à dissolution complète.</li>
	<li>Incuber l’échantillon pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Jetez le surnageant. REMARQUE : Le PEG-8000 à 30% est très visqueux et le granulé peut se déloger lors de la mise au rebut du surnageant. Le surnageant doit être transvasé lentement et soigneusement pour s’assurer que la pastille n’est pas perdue. Les étapes 2.6 à 2.23 sont effectuées à l’aide du kit d’extraction d’ADN du sol selon les instructions du kit, avec quelques modifications.</li>
	<li>Dissoudre la pastille dans 800 μL de la solution de lyse du kit et ajouter la solution dans le tube à billes de zirconium mélangé. REMARQUE : Si vous traitez de plus grands volumes, regroupez les granulés du nombre souhaité de tubes. Par exemple, si vous traitez 160 mL d’échantillon ; il y aura quatre tubes de 50 mL contenant des eaux usées contenant du PEG et du NaCl. Après centrifugation des quatre tubes à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min, jeter le surnageant des quatre tubes. Ajoutez 200 μL de solution CD1 à chacun, remettez les pastilles en suspension et regroupez-les dans un tube à billes.</li>
	<li>Fixez le tube de perle horizontalement sur un vortex. Vortex le tube à vitesse maximale pendant 20-30 min. REMARQUE : Le vortex prolongé assure la lyse et l’homogénéisation complètes des échantillons, ce qui améliore le rendement en ADN.</li>
	<li>Faites tourner les tubes à 8 000 x g pendant 15 s pour déposer les billes au fond, retirez la mousse et transférez complètement le surnageant du tube dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Certaines perles peuvent également être transférées au cours de cette étape.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant à 15 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml. Le surnageant peut encore contenir quelques particules en suspension.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution de précipitant et agiter à vitesse maximale pendant 5 s. Incuber à 4 °C pendant 5 min. REMARQUE : L’incubation à 4 °C augmente l’efficacité de la précipitation des protéines et des débris cellulaires pendant que l’ADN reste en solution. Il est possible d’interrompre le protocole à cette étape jusqu’à 2 h sans diminution significative du rendement et de la qualité de l’ADN extrait.</li>
	<li>Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT). Évitez la pastille et transférez le surnageant transparent dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de tampon de liaison par 700 μL de surnageant et vortex à vitesse maximale pendant 5 s.</li>
	<li>Chargez 700 μL de lysat sur une colonne de spin de silice, incubez pendant 2 min et centrifugez à 15 000 x g pendant 1 min. REMARQUE : L’incubation du lysat sur la colonne de silice améliore la liaison de l’ADN à la colonne, ce qui se traduit par un meilleur rendement en ADN.</li>
	<li>Jetez l’écoulement et répétez l’étape 2.14 jusqu’à ce que tout le lysat ait traversé la colonne d’essorage.</li>
	<li>Placez délicatement la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 ml. Assurez-vous qu’aucun flux n’est éclaboussé sur la colonne d’essorage.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’essorage et centrifugez la colonne d’essorage à 15 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Jeter le liquide d’écoulement et remettre la colonne d’essorage dans le même tube de collecte de 2 ml.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de tampon de lavage à l’éthanol dans la colonne d’essorage. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Jetez le liquide d’écoulement et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.</li>
	<li>Centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min pour éliminer l’éthanol résiduel. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de 1,5 ml.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de tampon d’élution (préchauffé à 55 °C) au centre de la membrane filtrante blanche et incuber pendant 5 min. REMARQUE : Le tampon d’élution chauffé, ainsi que l’incubation sur la membrane, augmentent l’efficacité de l’élution de l’ADN, en particulier de l’ADN de haut poids moléculaire.</li>
	<li>Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min. Jetez la colonne de rotation.</li>
	<li>À l’ADN élué, ajouter 10 μL de NaCl 3 M (1/10 volume d’éluat d’ADN) et 250 μL d’éthanol absolu réfrigéré (2,5 volumes d’éluat d’ADN). Retournez pour bien mélanger et faites tourner le contenu à 8 000 x g pendant 15 s.</li>
	<li>Incuber le mélange ADN-éthanol à -20 °C pendant au moins 1 h. REMARQUE : L’incubation du mélange ADN-éthanol peut être augmentée à 16 h sans diminution significative du rendement ou de la qualité de l’ADN extrait.</li>
	<li>Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 30 min. Jeter le surnageant par décantation.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans la pastille.</li>
	<li>Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant par décantation.</li>
	<li>Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.</li>
	<li>Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé.</li>
	<li>Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 30 à 50 μL d’eau double distillée autoclavée (ddH2O). Incuber à 37 °C pendant 5 à 10 min.</li>
	<li>Faites tourner l’ADN à 8 000 x g pendant 15 s.</li>
	<li>Sélectionnez l’application dsDNA dans les paramètres Acides nucléiques d’un spectrophotomètre Nanodrop.<ol><li>Nettoyez le socle avec du papier de soie non pelucheux et de l’eau. Utilisez le ddH2O pour effacer l’instrument, puis chargez 2 μL de l’échantillon d’ADN sur le socle.</li>
		<li>Mesurer les rapports de concentration et d’absorbance (A260/280 et A260/230) pour déterminer la pureté.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservez l’échantillon d’ADN à -20 °C.</li>
</ol>3. Précipitation de l’ADN linéaire amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour vérifier la récupération de l’ADN sur une gamme de poids moléculaires
<ol><li>À l’aide de l’ADN génomique d’E. coli MG155, amplifier les fragments de gènes par PCR pour générer un pool de fragments linéaires à partir des gènes suivants : fusA, lacZ, gapA, rpsD, ARNr 16S, marR (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces et les conditions de PCR).</li>
	<li>Purifiez les produits PCR à l’aide du kit de purification PCR et regroupez les produits PCR entre eux.</li>
	<li>Divisez les amplicons regroupés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de volumes égaux - étiquetez un tube comme « ADN d’entrée ».</li>
	<li>Ajoutez du PEG et du NaCl selon les conditions souhaitées (9 %, 20 %, 30 % PEG-8000 ; 0,3 M, 1,2 M de NaCl) dans chacun des tubes, à l’exception de celui étiqueté « ADN d’entrée », et augmentez le volume final à 1 ml.</li>
	<li>Incuber les tubes pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C. REMARQUE : Pour le reste des étapes jusqu’à 3.16, 'Input DNA' est conservé inchangé dans le réfrigérateur.</li>
	<li>Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse de table selon la vitesse souhaitée (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Retirez avec précaution 900 μL de surnageant du côté opposé à la pastille à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Premier lavage à l’éthanol : Ajoutez 900 μL d’éthanol à 70 % réfrigéré dans la pastille et mélangez en inversant doucement les tubes.</li>
	<li>Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant par décantation.</li>
	<li>Deuxième lavage à l’éthanol : Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans le granulé.</li>
	<li>Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation.</li>
	<li>Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.</li>
	<li>Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol s’évapore.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 20 μL d’eau bidistillée autoclave.</li>
	<li>Mesurez la concentration d’ADN précipitée par les différentes conditions et l’ADN d’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ou d’un fluoromètre.</li>
	<li>Chargez l’ADN précipité sur un gel d’agarose à 1 % pour la visualisation de l’ADN.</li>
</ol>

Technique efficace d’évaluation de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement en enrichissant l’ADN de faible MW

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La résistance aux antimicrobiens est l’une des 10 principales menaces pour la santé aujourd’hui, selon l’OMS, et la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens est reconnue comme un outil important dans le monde entier. Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction, un registre complet de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement comprend de l’ADN de faible poids moléculaire, fragmenté et extracellulaire. Le protocole de prétraitement rapporté ici, utilisant une forte concentration de PEG combinée à du sel (30% de PEG et 1,2 M de NaCl), permet d’obtenir ce résultat en enrichissant la proportion d’ADN de faible poids moléculaire sans affecter l’extraction de fractions de poids moléculaire supérieur (principalement de l’ADN génomique et plasmidique). Cela contraste avec les méthodes de concentration précédentes utilisant des protocoles de PEG plus faibles et de kits directs (sans prétraitement) qui sont lourds en raison de la nécessité de traiter de gros volumes. Le prétraitement avec des concentrations de PEG plus faibles s’est avéré inefficace pour récupérer l’ADN de faible poids moléculaire (« faible » fait référence aux bandes d’ADN inférieures à 600 pb ici). Lorsqu’aucun PEG n’est utilisé pendant le prétraitement, l’extraction de l’ADN est médiocre, ce qui fait que seulement 10 % de l’ADN d’entrée est récupéré, contre 70 % lorsque le PEG et le NaCl sont utilisés (figure 8). En plus de l’ajout de PEG et de NaCl, une autre étape importante est l’élimination de l’éthanol résiduel après l’extraction de l’ADN du kit afin d’obtenir de l’ADN pur pour le traitement en aval. Il est important de déterminer le volume initial d’eau nécessaire pour obtenir une quantité totale d’au moins ~300 ng à 5 mg d’ADN dans un volume de 30 à 50 ml lors de l’élution. Contrairement à 1 L ou plus d’eau qui est généralement traitée pour l’extraction de l’ADN des eaux usées27,41, il a été constaté qu’avec l’étape de prétraitement proposée ici, seulement 27,5 à 40 ml suffisent pour obtenir de l’ADN de haute qualité pour le traitement en aval. Les eaux usées contiennent également des particules et des matières organiques, qui peuvent contenir des cellules bactériennes adsorbées et de l’ADN extracellulaire. Par conséquent, la désorption des cellules et de l’ADN accompagnée de la lyse cellulaire est une étape importante pour augmenter le rendement en ADN. Des concentrations élevées de PEG rendent l’échantillon visqueux et peuvent entraver les étapes de lyse et de désorption pour l’extraction de l’ADN, comme mentionné précédemment. Pour éviter cela, une méthode d’extraction de l’ADN par étapes a été proposée, comme indiqué dans l’organigramme (figure 9). Cette méthode sera utile pour extraire à la fois l’ADN intracellulaire de haut poids moléculaire (Figure 7) et l’ADN fragmenté et circulaire extracellulaire de faible poids moléculaire.
L’une des limites actuelles de ce protocole en termes de coût est le traitement continu de l’ADN enrichi de faible poids moléculaire à travers un kit pour améliorer la qualité. Cette limitation peut potentiellement être contournée en utilisant d’autres méthodes de nettoyage de l’ADN, comme l’extraction au phénol-chloroforme. Une autre limitation pratique est la manipulation de concentrations élevées de PEG, car la pastille peut être perdue en raison de la viscosité élevée de la solution. Actuellement, un prétraitement à l’aide de PEG et de NaCl est effectué, suivi d’une version modifiée d’un protocole de kit existant, c’est-à-dire que le kit est toujours utilisé pour la purification finale de l’ADN. Une purification sans kit de l’ADN, qui donne un rendement d’ADN élevé mais de faible pureté (non rapporté ici), est en cours d’optimisation pour améliorer la qualité de l’ADN extrait. En raison de la nature visqueuse des solutions PEG, il faut viser une concentration optimale de PEG, capable de produire une gamme complète de tailles d’ADN tout en étant manipulée confortablement. L’abaissement de la concentration à 20 % (figure 6B) a permis d’obtenir un résultat intermédiaire aux efficacités d’extraction de PEG faible (9 %) et élevé (30 %) ; Cela vaudra peut-être la peine d’y donner suite dans le cadre de travaux futurs.
Le PEG est couramment utilisé lors des différentes étapes de l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux. Cependant, l’utilisation du PEG n’a pas été normalisée pour l’extraction de l’ADN dans le contexte de la surveillance de la RAM. La surveillance des eaux usées implique la détection de la résistance aux antimicrobiens dans de nombreux créneaux différents, y compris les stations d’épuration et les effluents et les drains ouverts et fermés 8,27. Bien que l’information sur la résistance aux antimicrobiens dans l’affluent fournisse des renseignements cruciaux sur la résistance qui circule dans la communauté, la présence de gènes de résistance aux antimicrobiens dans l’effluent est tout aussi importante pour mesurer et potentiellement prédire l’émergence d’éclosions de résistance. Les échantillons d’effluents ont généralement une faible charge microbienne car la plupart des cellules sont tuées pendant le processus de traitement, ce qui entraîne un très faible rendement en ADN cellulaire. Cependant, les effluents contiennent de l’ADN extracellulaire flottant comprenant à la fois de l’ADN génomique de haut poids moléculaire et un plasmide de faible poids moléculaire, des phagémides et de l’ADN fragmenté. Les gènes AMR présents dans l’ADN de faible poids moléculaire (fragmenté et plasmide/phagémides) peuvent être transférés aux cellules vivantes restantes dans l’effluent, entraînant la dissémination de la résistance 30,41,45. Par conséquent, il est important de détecter l’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire dans les eaux usées. Les autres méthodes employées pour l’extraction de l’ADN des eaux usées lors de l’évaluation de la résistance aux antimicrobiens n’assurent généralement pas l’enrichissement initial de l’ADN de faible poids moléculaire. Cette approche d’extraction d’ADN à partir des eaux usées peut être utilisée pour fournir des informations sur un résistome complet de l’environnement.

Le SRAS-CoV-2 et ses conséquences ont souligné l’importance de la surveillance environnementale dans le suivi et la prévision des épidémies de maladies infectieuses 1,2. Bien que les pandémies virales soient apparentes, l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est souvent décrite comme une pandémie insidieuse qui constitue un problème de santé publique majeur dans le monde 3,4. Par conséquent, il est urgent d’élaborer des stratégies coordonnées pour comprendre l’évolution et la propagation de la RAM. Les plans d’eau, ainsi que les eaux usées, peuvent servir de réservoirs pour les agents pathogènes et les RAM5, 6, 7 et 8. Les sources d’eau partagées sont donc une source puissante de transmission de maladies parmi les humains, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) où le manque d’hygiène et la surpopulation vont de pair 9,10,11. L’analyse des sources d’eau est utilisée depuis longtemps pour évaluer la santé communautaire 12,13,14. Récemment, les eaux usées des stations d’épuration urbaines se sont avérées être un bon indicateur précoce des cas de COVID dans les cliniques 1,2,15,16,17,18.
Par rapport à la surveillance de maladies spécifiques, la détection et le suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement posent un problème plus complexe. Le grand nombre d’antibiotiques utilisés, la diversité des gènes de résistance, les différentes pressions de sélection locale et le transfert horizontal de gènes entre les bactéries rendent difficile l’évaluation de la charge réelle de la résistance aux antimicrobiens et, une fois évaluée, sa corrélation avec les observations cliniques 19,20,21,22. Par conséquent, alors que la surveillance concertée de la résistance aux antimicrobiens clinique est menée par plusieurs organisations à travers le monde 3,23,24, la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens n’en est qu’à ses balbutiements, comme en témoigne 19,25,26.
Au cours des dernières années, différentes méthodes de suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement ont été signalées 5,27, examinées dans28,29. Le point de départ de la plupart d’entre eux est l’extraction d’ADN de bonne qualité à partir d’échantillons environnementaux hétérogènes, ce qui constitue en soi un défi. De plus, l’ADN environnemental est généralement fragmenté en raison de l’exposition à un environnement hostile. L’ADN extracellulaire fragmenté est depuis longtemps reconnu comme un réservoir important de gènes AMR (examiné dans30, 31 et 32), avec le potentiel supplémentaire d’entrer et de sortir des bactéries par transfert horizontal de gènes. Par conséquent, il est important que tout protocole visant à mesurer la charge de résistance aux antimicrobiens dans l’environnement échantillonne le mieux possible l’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Étonnamment, peu d’attention a été accordée au développement de méthodes spécifiques à l’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire : ce travail se concentre sur la résolution de cette lacune.
Une méthode simple et courante pour précipiter l’ADN consiste à combiner du polyéthylène glycol (PEG) et des sels tels que le chlorure de sodium (NaCl)33. Le PEG est un agent d’encombrement macromoléculaire utilisé pour obtenir une précipitation spécifique à la taille des fragments d’ADN34,35. Plus la concentration de PEG est faible, plus le poids moléculaire de l’ADN qui peut être précipité efficacement est élevé. De nombreuses études ont utilisé le PEG lors de l’extraction environnementale de l’ADN et de l’ARN 1,2 (résumés dans le tableau 1 17,33,36,37,38,39) soit à l’étape finale 33,36,37, soit pour concentrer de grands échantillons d’eau pour l’extraction de particules virales comme avec le SARS-CoV-2 15,40. Dans les travaux actuels, on constate que les concentrations de PEG utilisées précédemment pour les extractions d’ADN environnemental (largement déterminées par les protocoles de surveillance virale) ne capturent pas l’ADN linéaire de faible poids moléculaire. Par conséquent, ils ne permettent pas d’échantillonner de courts fragments d’ADN et ne conviennent pas à l’évaluation précise du contenu en RAM. Cette étude a exploité les propriétés du polyéthylène glycol et du chlorure de sodium pour précipiter efficacement des fragments d’ADN linéaires de faible poids moléculaire à un rendement élevé qui peut, à l’avenir, conduire à une méthode d’extraction d’ADN rentable. Cette méthode peut être utilisée pour enrichir la proportion d’ADN fragmenté et de faible poids moléculaire à partir d’échantillons naturels complexes, capturant ainsi une image plus précise de la RAM environnementale. Avec un peu plus de raffinement, la technique se prête à une application facile et peu coûteuse par les sociétés municipales locales et d’autres organismes gouvernementaux pour être utilisée comme outil de surveillance avec une formation technique minimale.

<table><tbody><tr><td>Microcentrifugeuse à 24 places</td><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>EP5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Éthanol absolu pour analyse)</td><td>Supelco</td><td>100983-0511</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée de paillasse</td><td>Eppendorf Centrifuge 5920 R</td><td>EP5948000131</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil Pro Kit</td><td>Qiagen</td><td>47014</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerWater Pro Kit</td><td>Qiagen</td><td>14900-100-NF</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (dNTP Mix 10mM chacun, 0.2 mL, R0191)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ADN polymérase, 5 U/&micro ; L + 10x DreamTaq Buffer*</td><td>Thermofscientific</td><td>EP0702</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 1 Kb Plus Express Échelle d’ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10488091</td><td></td></tr><tr><td>Maxiamp Tubes PCR 0,2 mL</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Eau de qualité pour PCR</td><td>HiMedia</td><td>ML065-1.5ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC Microvolume Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>13400519</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>SRL</td><td>54866</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR & Kit de nettoyage de gel</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorimètre (avec WiFi)</td><td>Thermofisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de dosage</td><td>Qubit Thermofisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs Qubitt pour ADN ds, large gamme</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32853 (500 dos)</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>HiMedia</td><td>TC046M-500G</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Teinture de gel d’ADN sans danger</td><td>Thermocycleur Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>(système PCR ProFlex 3 x 32 puits)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Kit de purification d’ADN génomique</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

amélioration de l’extraction de l’adn de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens 

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

La surveillance environnementale est reconnue comme un outil important pour évaluer la santé publique dans l’ère post-pandémique. L’eau, en particulier les eaux usées, est devenue la source de choix pour échantillonner les charges d’agents pathogènes dans l’environnement. Les eaux usées provenant des drains à ciel ouvert et des usines de traitement de l’eau des collectivités sont un réservoir d’agents pathogènes et de gènes de résistance aux antimicrobiens (RAM), et entrent fréquemment en contact avec les humains. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes pour suivre la résistance aux antimicrobiens dans l’eau, l’isolement d’ADN de bonne qualité à haut rendement à partir d’échantillons hétérogènes reste un défi. Pour compenser, les volumes d’échantillons doivent souvent être élevés, ce qui crée des contraintes pratiques. De plus, l’ADN environnemental est fréquemment fragmenté et les sources de RAM (plasmides, phages, ADN linéaire) sont constituées d’ADN de faible poids moléculaire. Pourtant, peu de procédés d’extraction se sont concentrés sur des méthodes d’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Ici, une méthode simple d’extraction linéaire d’ADN à haut rendement à partir de petits volumes d’eaux usées en utilisant les propriétés de précipitation du polyéthylène glycol (PEG) est présentée. Cette étude plaide en faveur de l’augmentation des rendements globaux en ADN à partir d’échantillons d’eau collectés pour des analyses métagénomiques en enrichissant la proportion d’ADN linéaire. De plus, l’amélioration de l’ADN de faible poids moléculaire permet de surmonter le problème actuel du sous-échantillonnage de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement en raison de l’accent mis sur l’ADN de haut poids moléculaire et intracellulaire. Cette méthode devrait être particulièrement utile lorsque l’ADN extracellulaire existe, mais à de faibles concentrations, comme dans le cas des effluents des usines de traitement. Il devrait également améliorer l’échantillonnage environnemental des fragments de gènes de la résistance aux antimicrobiens qui se propagent par transfert horizontal de gènes.

Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.

Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens 

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Ce protocole décrit l'utilisation d'un flux de fibres creuses système d'ultrafiltration tangentielle concentration de l'échantillon et une dissociation de chaleur étapes alternatives pour la détection de...

Une méthode mise à jour EPA 1623 qui utilise tangentielle débit à fibres creuses d&#39;ultrafiltration et de chaleur étapes de dissociation pour la détection de voie d&#39;eau<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Et<em&gt; Giardia spp.</em

Source : Ghadigaonkar, D. et Rath, A. Isolement et identification des bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2023)Cette vidéo montre l’isolement et la préparation de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir d’un échantillon d’eau à l’aide de milieux sélectifs. L’ADN est extrait de bactéries résistantes aux antibiotiques et amplifié pour identifier les gènes bactériens...

Isolement de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir d’un échantillon d’eau pour analyse moléculaire

L’isolement des microbes résistants aux métaux lourds des sources géothermiques est un sujet brûlant pour le développement de biosystèmes de bioremédiation et de surveillance de l’environnement. Cette étude fournit une approche méthodologique pour isoler et identifier les bactéries tolérantes aux métaux lourds des sources chaudes.

Bioprospection de micro-organismes extrêmophiles pour lutter contre la pollution de l’environnement

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et l’identification de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir de l’eau et la caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques (ARG). L’utilisation de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique) fournit des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans les eaux douces de Mumbai, en Inde.

Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques

Le protocole détecte les principaux gènes du cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas et visualise leur distribution spatiale afin d’améliorer la compréhension de la régulation du méthane et de ses impacts environnementaux dans ces écosystèmes dynamiques.

Visualisation de la dynamique microbienne du cycle du méthane dans les zones humides côtières

Des formes fiables et précises d’analyse ADN déployable sur le terrain sont cruciales pour de nombreux secteurs. Cet article propose deux méthodes d’analyse microbienne environnementale sur le terrain : 1) l’isolement de l’ADN microbien à partir d’échantillons environnementaux à l’aide d’un kit d’extraction biologique sur le terrain, et 2) l’analyse de l’ADN via l’unité qPCR de champ.

Analyse de l’ADN microbien sur le terrain à l’aide d’un kit d’extraction biologique et d’une unité qPCR de terrain

Nous décrivons une méthode pour l'extraction d'ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

Cette vidéo montre le protocole d'extraction d'ADN à partir du matériel fixé au formol et inclus en paraffine. Ceci est une procédure de plusieurs jours dans lequel des coupes de tissus sont déparaffinées avec du xylène, réhydratée avec de l'éthanol et traités à la protéinase K pour purifier et d'isoler l'ADN pour l'analyse des gènes spécifiques ou du génome à l'échelle suivante.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Découvrez une méthode d'extraction d'ADN de faible poids moléculaire à partir d'eaux usées pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementale. Cette technique permet de capturer les gènes de résistance génomiques et transférés horizontalement.

Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens (Vidéo) | JoVE Journal

Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens

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