Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens
19 juillet 2024
Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.
Nous nous intéressons à l’évolution, à la transmission et aux mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance aux antibiotiques. Plus précisément, le travail qui alimente cet article provient de notre intérêt pour la résistance environnementale. À l’heure actuelle, nous essayons de créer une base de données locale pour suivre la variation spatio-temporelle de la résistance aux antimicrobiens à l’aide d’une année de données.
Une combinaison de techniques basées sur la culture et la génomique est utilisée pour détecter et surveiller la résistance aux antimicrobiens. L’ADN des échantillons est soumis à un séquençage par PCR ou par shotgun pour profiler la diversité microbienne et détecter les gènes de résistance. De plus, le métacodage à barres et les panels AMR basés sur les gènes sont utilisés pour la détection avancée de la RAM.
L’ADN fragmenté de faible poids moléculaire est connu pour être un réservoir de gènes AMR, mais peu d’attention a été accordée au développement de méthodes spécifiques à l’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Notre travail vise à combler cette lacune. Notre protocole introduit une étape simple de prétraitement pour enrichir la proportion d’ADN de faible poids moléculaire extrait des eaux usées.
Par conséquent, cela permet de capturer la RAM environnementale dans son intégralité sans exclure les fractions d’ADN libres. Ce protocole peut être développé en une méthode sans kit avec un peu plus de travail. Cela ouvre la voie à la mise au point de techniques rentables de capture de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement.
Nous voulons aller au-delà de la résistance mutationnelle et explorer la contribution des mécanismes non génétiques à la résistance aux antibiotiques. Nous nous intéressons plus particulièrement à la comparaison des contributions relatives du transfert horizontal de gènes et des mutations génomiques à l’adaptation aux antibiotiques dans différents environnements.
Aperçu
Cette étude développe une technique novatrice pour évaluer la résistance aux antimicrobiens dans l'environnement (RAM) en enrichissant l'ADN extracellulaire de faible masse moléculaire provenant d'échantillons d'eaux usées. Le protocole permet la détection de gènes de RAM génomiques et transférés horizontalement, offrant une méthode rentable, sans kit, pour le suivi environnemental de la RAM.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Résistance aux antimicrobiens (RAM)
- Microbiologie environnementale
- Génétique moléculaire
Contexte
- L'évolution et la transmission de la résistance aux antibiotiques dans les environnements naturels
- Les lacunes actuelles dans les techniques de haute rendement d'extraction de l'ADN de faible masse moléculaire
- L'importance du suivi de la RAM pour la santé publique
Méthodes utilisées
- PCR et séquençage aléatoire pour le profilage de la diversité microbienne
- Utilisation du polyéthylène glycol et du chlorure de sodium pour l'extraction de l'ADN
- Détection avancée des gènes de résistance aux antimicrobiens par métabarcoding et panneaux génétiques
Résultats principaux
- Extraction améliorée de l'ADN linéaire et de bas poids moléculaire
- Capture réussie des fractions d'ADN génomique et libre associées à la RMA
- Travaux fondamentaux pour les développements futurs des techniques de détection de la RMA environnementale
Conclusions
- L'étude fournit une méthode efficace pour évaluer la RAM environnementale
- Encourage des recherches supplémentaires sur les facteurs génétiques et non génétiques contribuant à la résistance aux antibiotiques
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détection exhaustive de la résistance aux antimicrobiens (RAM) dans les échantillons environnementaux est essentielle pour l'évaluation précoce des risques et la surveillance de la santé publique. L'extraction améliorée de l'ADN de bas poids moléculaire à partir des eaux usées permet une caractérisation plus complète des réservoirs de gènes de RAM, y compris ceux diffusés par transfert horizontal de gènes. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive de la surveillance environnementale de la RAM et éclaire les décisions stratégiques en matière de surveillance et de mesures d'atténuation.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la Découverte et Validation de la Cible
- Permet l'interrogation des réservoirs environnementaux de gènes de résistance aux antimicrobiens au-delà de l'ADN intracellulaire.
- Permet la validation fonctionnelle de la mobilité des gènes de résistance aux antimicrobiens et de leurs voies de transmission.
- Améliore la fiabilité prédictive des modèles de risque environnemental concernant l'émergence de la résistance aux antimicrobiens.
Développement de tests et criblage
- Facilite la préparation d'échantillons d'ADN adaptés aux panneaux de métagénomique et de PCR ciblant les gènes de résistance aux antimicrobiens (AMR).
- Améliore la reproductibilité des tests en standardisant l'extraction de l'ADN fragmenté et extracellulaire.
- Permet une détection fiable de fragments de gènes AMR peu abondants pour les analyses en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la surveillance environnementale de la RAM avec la découverte translationnelle de biomarqueurs pour la santé publique.
- Assure la continuité entre la détection environnementale et l'évaluation préclinique des risques liés à la propagation de la RAM.
- Permet une détection mécanistique des risques en ciblant à la fois les éléments génétiques et les résistances transférées horizontalement.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode d'extraction s'intègre dans le processus de surveillance environnementale, depuis le prélèvement des échantillons jusqu'à l'analyse métagénomique et le profilage des gènes de résistance aux antimicrobiens.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la prévalence et la mobilité des gènes de résistance aux antimicrobiens (RAM) dans les environnements d'eaux usées.
- Dépistage : Standardise l'extraction d'ADN pour une détection reproductible et quantitative des gènes de RAM.
- Analytique : Fournit de l'ADN de bas poids moléculaire et à haut rendement pour des analyses comparatives solides entre échantillons et points temporels.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la détection environnementale des résistances aux antimicrobiens et les stratégies de biomarqueurs en santé publique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un protocole évolutif, indépendant des kits, adaptable à diverses matrices environnementales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive de la surveillance de la RAM en capturant l'ADN fragmenté et extracellulaire.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole d'extraction standardisé et à haut rendement, adapté à une surveillance de routine.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées quant à l'engagement ou non de mesures et d'investissements pour atténuer et surveiller la RAM.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes de surveillance environnementale de la RAM.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en extraction d'ADN environnemental et en analyses moléculaires en aval.
- Suppose l'accès à une infrastructure comprenant la centrifugation, la spectrophotométrie et les équipements standards de biologie moléculaire.
- Exige une standardisation entre équipes pour un traitement reproductible des échantillons et une comparabilité des données.
- Peut être adapté à divers types d'échantillons environnementaux et d'eaux usées moyennant une optimisation du protocole.
- Est limité par la nécessité d'une manipulation soigneuse de l'ADN fragmenté afin d'éviter toute perte durant le traitement.
