Profilage des O-glycanes de mucine perméthylée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Nous étudions la glycobiologie des interactions entre les microbes de l’hôte dans le tractus gastro-intestinal, en nous concentrant sur le rôle de la couche muqueuse recouvrant le tractus gastro-intestinal, et en particulier les mucines et leurs glycanes dans la santé et la maladie. Les mucinglycanes sont de plus en plus reconnus comme des facteurs importants dans les interactions hôte-microbe car ils fournissent des nutriments et des sites de liaison aux bactéries. Une altération du profil de glycosylation peut entraîner une perturbation de la composition microbiotique, et inversement, des phénotypes couramment observés dans les pathologies.

Cependant, les mucines sont notoirement difficiles à étudier car elles sont fortement glycosylées. Les innovations dans les techniques d’échantillonnage et l’analyse bioinformatique de suivi peuvent faire avancer le domaine, tout comme de nouvelles approches de traitement des échantillons pour augmenter le débit et réduire le temps entre la collecte et les résultats. D’autres techniques analytiques permettent une caractérisation structurelle plus détaillée des glycanes, mais nécessitent une longue durée d’analyse et de longue durée.

La technique décrite ici utilisant la spectrométrie de masse MALDI-TOF présente un avantage de vitesse, ce qui la rend à haut débit et adaptée au dépistage et au profilage. Pour commencer, mélangez des mucines purifiées avec 250 microlitres de tampon d’élimination bêta-élimination dans un flacon en verre de quatre millilitres. Scellez fermement le flacon avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène et incubez la réaction à 45 degrés Celsius pendant 16 heures.

Sur la glace, ajoutez un millilitre de solution d’acide acétique à 5 % au mélange de réaction selon les gouttes. Pour désaler l’échantillon, bouchez une pipette en verre avec une petite quantité de laine de verre. Ajoutez 1,5 millilitre de suspension en résine à la pipette en verre par le dessus, puis laissez-la se déposer et s’écouler.

Ensuite, lavez la résine avec deux millilitres d’acide acétique à 5 % et jetez le flowthrough. Ensuite, ajoutez l’échantillon de mucine à la colonne de désalage et collectez le flux dans un tube de cinq millilitres. Lavez la colonne deux fois avec un millilitre d’acide acétique à 5 % pour collecter le flux de flux.

Ensuite, à l’aide d’un évaporateur centrifuge, retirez l’acide acétique et concentrez l’échantillon à cinq millibars et 30 degrés Celsius pendant deux heures. Dissoudre l’échantillon dans 0,5 millilitre d’acide acétique méthanolique, puis le faire sécher sous un jet d’azote. À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez quatre millilitres de DMSO dans le flacon contenant l’hydroxyde de sodium et le mélange de méthanol.

Après le vortex, centrifugez la solution à 2 000 G pendant deux minutes. Décantez soigneusement le surnageant et retirez les sels sans déranger le gel. Après s’être assuré qu’aucun autre sel ne se forme, resuspendez le gel dans quatre millilitres de DMSO anhydre pour préparer la suspension à base de perméthylation.

Ensuite, sur l’échantillon de mucine séchée, ajoutez du DMSO anhydre et une base de perméthylation immédiatement suivis d’iodométhane. Incubez la réaction de perméthylation pendant 30 minutes à température ambiante avec des secousses vigoureuses. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitres d’eau pour arrêter la réaction.

Après que l’échantillon devienne trouble, rincée-le avec de l’azote jusqu’à ce qu’il devienne clair. Chargez l’échantillon sur une plaque d’extraction hydrophile à balance lipophile à 96 puits. Appliquez une pression positive pour pousser les échantillons à travers la phase solide à un débit d’environ un millilitre par minute.

Après avoir écarté le flowthrough, lavez les puits deux fois avec un millilitre d’eau. Éluez les glycanes de la plaque deux fois avec un millilitre de méthanol. Appliquez la pression uniquement jusqu’à ce que le méthanol commence à sortir de la plaque, puis laissez l’écoulement gravitationnel maintenir le débit requis.

Séchez l’échantillon à l’aide d’un évaporateur centrifuge et dissouds-le dans 10 microlitres de TA50. Après avoir mélangé un microlitre d’échantillon et la matrice, chargez-le sur une plaque en acier cible MALDI et laissez-le sécher. Pour l’analyse des données, chargez le fichier ASCII exporté du spectre de masse dans GlycoWorkbench.

Après avoir effectué la correction de base, calculez les centroïdes de pic et, dans la fenêtre pop-up, sélectionnez la plage de masse appropriée, le rapport signal sur bruit minimal et l’intensité de pic minimale de la spectrométrie de masse. Ensuite, utilisez l’outil Glyco-Peakfinder pour identifier les compositions structurales correspondant à la liste des pics. Choisissez perMe comme dérivitisation, redEnd comme extrémité réductrice, et fixez le nombre minimum et maximum de résidus attendus.

Pour les mucines, sélectionnez Hexose, N-Acétyl-Hexosamine, Désoxy-Hexase et N-Acétylneuraminique. Pour les glycanes sulfates, utilisez l’option Autre résidu avec une masse de 87,9. Pour les données MALDI-TOF, fixez le nombre maximal d’ions sodium et de charges à un par chacun, et fixez la précision à 0,5 Daltons.

Sélectionnez toutes les annotations correctes avec la touche Control et cliquez sur chacune d’elles. Faites un clic droit sur les annotations sélectionnées et choisissez Ajouter à la liste des pics annotés. Pour générer un rapport comparant plusieurs spectres annotés, allez dans Outils suivi de Rapports et créez un rapport comparant différents profils.

Imprimez le rapport en PDF pour l’enregistrer. Pour l’analyse des spectres de fragmentation, chargez les spectres sur GlycoWorkbench et générez la liste des pics comme démontré précédemment. Dessinez des structures glycanes supposées correspondant aux compositions annotées des glycans.

Pour générer des fragments pour chaque structure, faites un clic droit pour sélectionner Copier les fragments dans la toile et choisissez Calculer les fragments dans l’outil Fragments. Pour une analyse de fragmentation plus approfondie, cliquez sur un pic d’intérêt dans le visualiseur de spectre. Faites un clic droit et sélectionnez Trouver toutes les structures correspondant aux pics pour interroger le rapport de charge maître du pic sélectionné par rapport aux bases de données en ligne.

Sélectionnez les structures présumées d’intérêt et faites un clic droit pour les copier dans la fenêtre de toile avec l’option appropriée. Pour calculer les fragments possibles de chaque structure glycane, sélectionnez la structure dans la toile. Ensuite, sous outils et fragments, sélectionnez fragments de calcul pour la structure courante.

Si des fragments pour plus d’une structure glycane ont été calculés, rendez-vous dans la vue tableau Fragments sous l’onglet Résumé pour consulter la table de comparaison. Sélectionnez les fragments correspondant à la liste des pics pour chaque structure glycane potentielle. Faites un clic droit et choisissez Copier les fragments sur toile depuis le menu déroulant.

Enfin, dans l’onglet Outils, allez dans Profileur suivi de Annoter les pics avec toutes les structures. Ensuite, sélectionnez Outils, Rapports, et créez un rapport des annotations. Le dessalage par échange d’ions a permis une meilleure récupération des glycanes plus gros, ces structures plus grandes représentant 31 % du total des glycanes, contre 21 % pour l’extraction PGC.

Parmi les structures de glycanes identifiées, un seul a été identifié uniquement par l’échantillon désalinisé par échange d’ions. De plus, le dessalage par échange d’ions et élimination du borate a conduit à des spectres avec des rapports signal/bruit accrus par rapport à ceux produits après le dessalement par extraction en phase solide avec PGC. Des temps de réaction de perméthylation de 30 et 90 minutes ont permis d’identifier 33 pics de glycanes, tandis qu’une réaction de cinq minutes n’en a identifié que 31.