Microdissection à plusieurs niveaux et profilage fonctionnel-structurel des branches artérielles rénales humaines

Notre recherche vise à établir des méthodes standardisées pour isoler et évaluer fonctionnellement les branches artérielles rénales humaines, en découvrant les mécanismes de la dysfonction vasculaire et en guidant les thérapies ciblées. Des recherches antérieures reposaient sur des modèles animaux ou sur l’imagerie indirecte, où notre myographie filaire reflète directement la fonction de l’artère rénale humaine in vitro. Notre méthode permet une analyse vasculaire précise et spécifique à l’homme, surmontant les limites des espèces et améliorant le développement translationnel de médicaments.

Pour commencer, assurez-vous que le tissu rénal reste entièrement immergé dans le liquide pendant le transport afin de maintenir la viabilité et l’intégrité structurelle des tissus. Identifiez visuellement le plan coronal en localisant le hile rénal et en alignant la coupe pour qu’elle passe à travers le bassinet du rein et le bord convexe latéral. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez le rein en deux le long de ce plan coronal pour créer deux moitiés symétriques et exposez les structures internes, telles que les pyramides et les colonnes rénales.

Sous un microscope stéréoscopique, utilisez des ciseaux de microdissection et des pinces pour séparer méticuleusement les artères interlobaires, arquées et interlobulaires dans une boîte de culture à fond noir de 10 centimètres. Ensuite, retirez délicatement tous les tissus et la graisse environnants des artères disséquées dans la même boîte de culture à fond noir de 10 centimètres pour les nettoyer en profondeur. À l’aide de ciseaux de microdissection, sectionnez les artères nettoyées en anneaux d’environ deux millimètres de long pour les études de la fonction vasculaire.

Insérez soigneusement le premier fil de guidage dans un anneau artériel dans le plat. Pliez un côté du fil de guidage à un angle de 90 degrés et transférez l’anneau artériel avec le fil dans la chambre. Avant de fixer l’anneau artériel sur le porte-échantillon, notez la longueur du récipient.

Placez l’anneau entre les deux supports et lisez l’échelle du micromètre, où une division de l’échelle équivaut à 10 micromètres. Soustrayez la valeur d’échelle initiale mesurée lorsque les supports se touchent simplement pour calculer la longueur et la largeur de l’anneau artériel. Ensuite, fixez l’anneau artériel sur le porte-échantillon de type palourde à l’aide des vis fournies par l’instrument, en les serrant dans le sens des aiguilles d’une montre.

Ensuite, enfilez un deuxième fil-guide dans l’anneau artériel. Enroulez le fil dans le sens des aiguilles d’une montre autour des vis de fixation aux deux extrémités, en le fixant fermement à la surface du porte-échantillon. Sélectionnez Paramètres de normalisation dans le menu DMT et réglez l’étalonnage de l’oculaire sur un millimètre par division, la pression cible sur 13,3 kilopascal, IC1/IC100 sur 0,9, le temps de moyenne en ligne sur trois secondes et le temps de retard sur 60 secondes.

Sélectionnez le canal correspondant à l’artère cible, puis ouvrez l’écran Normalisation à partir du menu DMT. Dans les champs appropriés, entrez les points d’extrémité des tissus comme a1 est égal à zéro et a2 est égal à la longueur mesurée du vaisseau en millimètres. Entrez le diamètre du fil à 40 micromètres et entrez la lecture du micromètre sur l’échelle.

Cliquez sur Ajouter un point pour enregistrer les données. Appliquez maintenant un étirement passif et attendez trois minutes. Entrez la nouvelle lecture du micromètre comme point suivant et cliquez sur Ajouter un point.

Ajoutez cinq millilitres de solution à 60 ions potassium dans la chambre pour induire une contraction du vaisseau médiée par le potassium. Pour laver la solution à 60 ions potassium, ajoutez cinq millilitres de solution Krebs trois fois. Pour évaluer la contraction dépendante de la concentration induite par la phényléphrine, appliquez la phényléphrine cumulative par incréments d’un demi-log de 10 à la puissance moins neuf à la puissance 10 à la puissance moins quatre molaires.

Pour des tests de dépistage de drogues supplémentaires, lavez la chambre avec cinq millilitres chauds de solution de Krebs au moins cinq fois jusqu’à ce que la tension revienne à la ligne de base et reste stable pendant au moins 10 minutes. L’artère interlobaire a été disséquée avec succès à partir de la moelle rénale, montrant une paroi vasculaire épaisse et du tissu adipeux environnant qui ont nécessité un retrait soigneux pour préserver l’intégrité structurelle. L’artère arquée a été isolée au niveau de la jonction corticomédullaire, présentant une paroi vasculaire plus mince et une trajectoire arquée.

L’artère interlobulaire a été identifiée comme traversant linéairement le cortex rénal avec une paroi très mince et étroitement intégrée au tissu cortical. L’analyse histologique a révélé que l’artère interlobaire avait la paroi vasculaire la plus épaisse avec une ventupie distincte, tandis que les artères arquées et interlobulaires présentaient des parois progressivement plus minces et moins de couches musculaires lisses. La normalisation artérielle impliquait des étirements mécaniques répétés et une stimulation induite par le potassium, établissant des conditions de tension de base stables sur tous les échantillons.

L’addition cumulative de phényléphrine à la puissance moins neuf à 10 à la puissance moins quatre concentrations molaires a induit des contractions progressivement plus fortes dans les anneaux artériels de manière dose-dépendante. Dans les artères précontractées par la phényléphrine, l’augmentation des concentrations d’acétylcholine de 10 à la puissance moins huit à trois fois 10 à la puissance moins cinq molaires a produit une vasodilatation dépendante de la concentration.