Analyse immunoblot

L’immuno-transfert, souvent appelé Western blot, est utilisé pour identifier, dans un échantillon de protéines, des antigènes spécifiques reconnus par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Cette procédure suit généralement une électrophorèse sur gel ou 2D et implique le transfert de protéines séparées vers des membranes de nitrocellulose. Incubation de ces membranes avec des anticorps primaires et secondaires, directement ou indirectement conjugués à des enzymes et visualisation des antigènes protéiques sur ces membranes à l’aide de réactions de substrat coloré ou fluorescent

Dans cette vidéo, nous vous présentons une démonstration étape par étape d’une procédure d’immuno-buvardage. Bonjour, je m’appelle Sean Gallagher de l’UVPI et je collabore avec un centre de protéomique ici à l’Institut de hautes études et de hautes études du Connecticut. Aujourd’hui, je vais vous montrer l’analyse de l’immuno-buvardage.

Il implique un certain nombre d’étapes, notamment la séparation des protéines, le transfert des protéines sur les membranes, l’immunosonde et la visualisation avec des substrats de luminescence chromogènes et kim. Alors commençons. Avant de commencer la procédure d’immuno-transfert, les échantillons de protéines doivent d’abord être séparés par électrophorèse à l’aide de gels unidimensionnels ou de taille standard ou de taille standard.

Préparez les échantillons antigéniques et chargez-les dans les voies du gel, incluez des protéines précolorées ou biotinylées, des étalons de poids moléculaire dans une ou plusieurs des voies de gel. Ces marqueurs protéiques seront transférés à la membrane et indiqueront commodément l’orientation de la membrane et la taille des protéines après l’immunomarquage. Une fois l’électrophorèse terminée, nous sommes prêts à assembler l’immuno-blot.

Pour assembler l’immuno-blot Tout d’abord, démontez le sandwich de gel et retirez le gel d’empilement Équilibrez le gel pendant 30 minutes À température ambiante dans le tampon de transfert, cet équilibre est nécessaire pour éviter un changement de taille du gel pendant le transfert pendant que le gel s’équilibre. Commencez à assembler le sandwich de transfert dans un plateau suffisamment grand pour contenir la cassette de transfert en plastique, remplissez de tampon de transfert afin que la cassette soit couverte. Placez maintenant un tampon ou une éponge scotch bright sur la moitié inférieure de la cassette de transfert en plastique.

Prenez ensuite une feuille de papier filtre qui a été coupée à la même taille que le gel. Pré-mouillez-le avec un tampon de transfert et placez-le sur le tampon scotch bright. Une fois l’équilibrage du gel de 30 minutes terminé, placez le gel sur le papier filtre.

Éliminez toutes les bulles d’air entre le gel et le papier filtre en faisant rouler doucement un tube à essai ou une tige de verre sur la surface du gel. Ou vous pouvez utiliser le rouleau BioRad, qui est fourni avec le kit BioRad. N’oubliez pas d’utiliser des gants lorsque vous manipulez des papiers filtres, des gels et des membranes.

L’huile de vos mains bloquera le transfert. Ensuite, préparez la membrane de transfert. Coupez la membrane à la même taille que le gel plus un à deux millimètres sur chaque bord.

Ensuite, placez lentement la membrane dans de l’eau distillée avec un bord à un angle de 45 degrés, l’eau s’infiltrer dans la membrane et finira par mouiller toute la surface. S’il est inséré rapidement dans l’eau, l’air est piégé et apparaîtra sous forme de taches blanches dans la membrane. La protéine ne sera pas transférée sur ces zones.

Une fois que la membrane est complètement mouillée, équilibrez-la pendant 10 à 15 minutes et transférez le tampon. Ce procédé de mouillage fonctionne pour les membranes en nitrocellulose et en nylon. Seules les membranes en PVDF sont hydrophobes et ne sont pas mouillées simplement en étant placées dans de l’eau distillée ou en transférant. Tampon.

Les membranes PVDF doivent d’abord être immergées dans du méthanol à 100 % pendant une à deux secondes, puis équilibrées pendant 10 à 15 minutes. Dans le tampon de transfert. Ne laissez pas la membrane se dessécher à tout moment.

Si cela se produit, mouillez à nouveau avec du méthanol, puis le tampon de transfert. Une fois que la membrane est prête, placez la membrane pré-humidifiée directement sur la face supérieure du gel. N’oubliez pas d’éliminer toutes les bulles d’air entre le gel et la membrane en faisant rouler doucement un tube à essai, une tige de verre ou un rouleau BioRad sur la surface de la membrane.

Ensuite, mouillé, un autre morceau de papier filtre watman de trois mm. Ensuite, placez-le sur la membrane et encore une fois, retirez toutes les bulles d’air. Placez ensuite un autre tampon ou une éponge scotch bright sur ce papier filtre.

Terminez l’assemblage du sandwich immuno-blot en verrouillant la moitié supérieure de la cassette de transfert en place. Maintenant que le sandwich immunoblot est assemblé, nous sommes prêts à transférer les protéines du gel à la membrane. Pour commencer la procédure de transfert, remplissez le réservoir d’électrobuvard avec tampon de transfert et placez la cassette de transfert contenant le sandwich dans l’appareil d’électrotransfert.

Il est important pour le sandwich que la membrane fasse face à l’anode ou au côté chargé positivement du réservoir. Connectez les fils de l’alimentation aux côtés de l’anode et de la cathode correspondants de l’appareil d’électro-buvard. Ce buvard particulier est livré avec un bloc de glace rafraîchissant.

Maintenant, l’électrophorèse transfère les protéines du gel à la membrane pendant 30 à 60 minutes à 50 volts avec refroidissement ou toute la nuit à 14 volts dans une chambre froide. Une fois le transfert terminé, coupez l’alimentation électrique et démontez l’appareil. Retirez ensuite la membrane de l’appareil de transfert et notez l’orientation en coupant un coin.

À ce stade, les membranes peuvent être séchées et stockées dans un sac en plastique refermable à quatre degrés Celsius pendant un an. Avant de poursuivre le traitement, les membranes PVDF séchées doivent être placées dans une petite quantité de 100 % de méthanol pour mouiller la membrane. Puis dans de l’eau distillée pour éliminer le méthanol.

Une fois l’orientation marquée, colorez le gel pour vérifier l’efficacité du transfert. Pour visualiser les protéines transférées, vous pouvez soit colorer la membrane de manière réversible avec du rubis cipro, soit de manière irréversible avec de l’encre de Chine bleu de Kamasi, du bleu de naphtol ou de l’or colloïdal. Ces procédures de coloration irréversibles sont incompatibles avec les membranes en nylon.

Maintenant que les protéines sont transférées dans la membrane, procédez à l’immunosondage et à la détection visuelle des protéines. Dans cette étape, les protéines immobilisées sur la membrane sont sondées avec des anticorps spécifiques pour identifier et quantifier les antigènes présents. Pour commencer, placez la membrane dans un plateau d’incubation en plastique avec un tampon de blocage de 20 millilitres.

Certaines personnes utilisent des sacs, mais les plateaux sont souvent utilisés à la place, car ils sont particulièrement utiles lors du traitement d’un grand nombre de bandelettes dans différentes solutions d’anticorps primaires. Ensuite, incubez la membrane scellée pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avec agitation sur un agitateur orbital ou une plate-forme à bascule. Pendant l’incubation de la membrane, diluez l’anticorps primaire et le tampon de blocage.

La dilution est déterminée empiriquement, mais elle est généralement de un à 100 à un à 1000. Pour un anticorps polyclonal, un à 10 pour un sur 100 pour les surnageants hybrides et plus de un à 1000 pour les acides murins contenant des anticorps monoclonaux. Lorsque l’incubation est terminée, videz le tampon de blocage.

Remplacez le tampon par de l’anticorps primaire dilué, puis incubez de nouveau pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avec une agitation constante. Ensuite, lavez la membrane quatre fois en agitant avec 100 millilitres. TTBS pour les filtres NITROCELLULOSE ou PVDF ou TBS pour les filtres en nylon.

Laver pendant 10 à 15 minutes à chaque fois que la membrane est lavée, diluer l’anticorps secondaire dans un tampon de blocage. Des exemples d’anticorps secondaires comprennent la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline, le conjugué anti-IG, l’enzyme conjuguée disponible dans le commerce. Les anticorps secondaires sont généralement dilués de un à 200 à un à 25 000 avant d’être utilisés.

Une fois les étapes de lavage terminées et les matériaux de lavage jetés, ajoutez de la peroxydase de raifort diluée ou de la phosphatase alcaline, un conjugué anti-IG et incubez 30 à 60 minutes à température ambiante avec une agitation constante. Après 30 à 60 minutes, retirez la membrane du bac et lavez-la quatre fois, 10 à 15 minutes à chaque fois. Dans TTBS comme décrit précédemment.

Une fois les lavages terminés, nous sommes prêts à passer à l’étape de visualisation. Mais d’abord, nous allons faire la démonstration d’une procédure alternative d’immunosonde. Cette procédure alternative d’immuno-sondage est basée sur le kit de coloration vectorielle A BC de Vector Labs.

Il utilise un complexe de biotine avidan pour fixer la peroxydase de raifort ou HRPO ou phosphatase alcaline A, A, P, à l’anticorps secondaire biotinylé. Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration du kit HRPO. Le TTBS est bien adapté comme tampon de blocage pour les systèmes de biotine avadon.

Mais pour les filtres en nylon, les réactifs de liaison aux protéines sont recommandés car le lait écrémé en poudre contient de la biotine résiduelle, qui interférera avec l’immunodosage. Il ne doit être utilisé dans l’étape de blocage que pour commencer à équilibrer la membrane dans le tampon de blocage dans un plateau ouvert avec une agitation constante à l’aide d’un agitateur orbital ou d’une plate-forme à bascule. Incuber la membrane pendant 30 à 60 minutes à température ambiante pendant que la membrane s’équilibre.

Préparez la solution d’anticorps primaires. Utilisez le TTBS pour les membranes NITROCELLULOSE ou PVDF à haute sensibilité Aden. Systèmes à base de biotine.

La dilution des anticorps primaires contenant des cera varie généralement de un sur 1000 à un sur 100 000. L’utilisation de la chimie chimiluminescente nécessite une gamme plus élevée de dilutions. Dans notre cas, il s’agit d’une preuve chromogène.

Nous utilisons une dilution d’un sur 5 000 de la primaire. Une fois l’équilibrage effectué, retirez le tampon bloquant. Ajoutez ensuite suffisamment de solution d’anticorps primaires pour couvrir la membrane.

Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante avec un léger balancement après 30 minutes. Laver la membrane trois fois dans du TTBS pour la nitrocellulose à des intervalles de cinq minutes Pendant l’étape de lavage, préparez la solution d’anticorps secondaires biotinylés en diluant une goutte d’anticorps biotinylés avec 10 millilitres de TTBS. Une fois les étapes de lavage terminées, ajoutez la solution d’anticorps secondaire.

Incuber la membrane pendant 30 minutes à température ambiante avec un balancement lent pendant que la membrane est incubée avec des anticorps secondaires. Préparez l’avadon biotine HRPO pour ce faire. Mélangez deux gouttes de réactif de coloration vti A et deux gouttes de réactif B dans 10 millilitres.

TTBS pour nitrocellulose. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante lorsque l’incubation secondaire de l’anticorps est terminée. Laver la membrane trois fois sur une période de 15 minutes avec TTBS ou TBS.

Ensuite, ajoutez la solution d’enzyme de biotine avidan à la membrane et incubez pendant 30 minutes à température ambiante avec un balancement lent. Ensuite, lavez la membrane trois fois à 10 minutes d’intervalle avec TTBS. Maintenant que la procédure d’immuno-sondage est terminée, les protéines liées à la membrane sont prêtes à être visualisées avec des substrats chromogènes.

Pour cette dernière étape de visualisation, les substrats quatre CN dab slash ICL two et TMB sont couramment utilisés avec les procédures d’immunodétection à base de raifort et de peroxydase. Si le lavage final de la membrane pendant la procédure d’immunosonde a été effectué dans TTBS, puis a lavé la membrane pendant 15 minutes à température ambiante et 50 millilitres. TBS place maintenant la membrane dans la solution de visualisation chromogène.

Les bandes protéiques devraient apparaître dans 10 à 30 minutes. Après l’incubation de 30 minutes, jeter le mélange réactionnel du substrat et terminer la réaction en ajoutant de l’eau distillée. L’immunobuvardage est une procédure en plusieurs étapes utilisée par des milliers de laboratoires pour détecter la présence de protéines spécifiques à la suite d’une électrophorèse ou d’une électrophorèse 2D.

Je viens de vous montrer comment effectuer une analyse immuno-sanguine. Donc c’est tout. Bonne chance dans vos expériences et merci d’avoir regardé.