Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie
6 août 2008
Ce protocole met en évidence les principes et les applications pratiques de la phase et contraste interférentiel différentiel (DIC) Microscopie
La microscopie optique est l'un des outils les plus, sinon le plus, déterminants dans le domaine de la recherche biomédicale. Selon votre application, différents modes d'éclairage sont souhaitables pour l'observation des échantillons. Cette vidéo démontrera deux modes optiques d'éclairage en lumière transmise : le contraste de phase et la microscopie à contraste interférentiel, ou DIC (differential Interference contrast).
Bonjour, je suis Victoria San Frolic du centre d'imagerie optique de l'Université du Centre des sciences de la santé du Texas à San Antonio. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment observer correctement des échantillons en utilisant la microscopie en contraste de phase et en contraste interférentiel différentiel. Commençons donc.
La microscopie optique classique n'est pas adaptée à l'observation d'échantillons transparents et incolores. La microscopie en contraste de phase est souvent utilisée pour produire du contraste avec des spécimens biologiques transparents non absorbants de lumière. Cette technique a été découverte par Zurich en 1942, qui a reçu le prix Nobel pour cette réalisation.
Le microscope à contraste de phase est un microscope optique à champ clair doté d'objectifs spéciaux à contraste de phase, qui contiennent une lame ou une lame annulaire de phase, ainsi que d'un diaphragme annulaire remplaçant le diaphragme classique. L'anneau est généralement situé dans la tourelle du condenseur, et sa taille doit être choisie en fonction des différents objectifs. Après avoir réglé l'éclairage de Köhler, sélectionnez l'objectif à contraste de phase approprié, puis faites tourner l'anneau de phase correspondant en position dans le condenseur.
Une fois l'anneau de phase de l'objectif et l'anneau du condenseur correctement alignés de manière concentrique et superposée, nous pouvons observer l'échantillon et régler correctement la mise au point. Voyons donc à quoi ressemble le contraste de phase au microscope. Voici une image d'une coupe de foie de rat.
En contraste de phase. Cette méthode améliore la visualisation du matériel biologique en modifiant le contraste, passant de différentes nuances de gris à des nuances allant du noir au blanc. Vous remarquerez toutefois que les échantillons sont entourés d’un halo, qui masque les détails fins de la structure.
Cet halo est un artefact dû à l'éclairage par l'anneau de phase. Vous remarquerez maintenant que, lorsque nous passons en champ clair, cet échantillon est très difficile à observer. En revenant au contraste de phase, nous pouvons clairement voir la structure et la forme des cellules dans le tissu hépatique du rat depuis son introduction à la fin des années 1960.
La microscopie à contraste interférentiel ou microscopie CIN est largement utilisée en recherche biomédicale car elle produit des images haute résolution de structures fines en accentuant les interfaces contrastées ; l'image obtenue correspond à une section optique très mince. En effet, la capacité de la CIN à produire des sections optiques en a fait un mode d'éclairage en lumière transmise particulièrement utile en complément de la microscopie confocale. Le microscope CIN est un microscope optique en champ clair auquel on a ajouté les éléments suivants : un polariseur placé entre la source lumineuse et le condenseur.
Un prisme de séparation du faisceau DIC dans le condenseur, un prisme de combinaison du faisceau DIC juste derrière l'objectif et un analyseur dans l'espace à l'infini avant les deux lentilles. Pour obtenir les meilleures performances des optiques DIC, il est important d'abord d'aligner le microscope lumineux pour une illumination de Köhler, puis de placer les éléments DIC dans le trajet optique. La lumière provenant de la source traverse un polariseur, puis est divisée par le premier prisme.
Ces faisceaux jumelés voyagent proches l'un de l'autre. Si la paire traverse le même matériau dans l'échantillon, alors lorsqu'ils sont recombinés par le second prisme, ils ne s'interfèrent pas mutuellement et apparaissent donc en gris. Toutefois, au niveau d'un bord d'une structure, l'un des faisceaux du couple traverse un matériau différent de celui de son partenaire et est modifié.
Lorsque ces faisceaux sont recombinés par le second prisme, ils interfèrent soit de manière constructive, produisant une tache lumineuse, soit de manière destructive, produisant une tache sombre. Voici une observation de diatomées en contraste DIC. Vous remarquerez que les détails fins de la structure des diatomées sont clairement visibles.
Cependant, si les optiques de contraste interférentiel différentiel (DIC) sont retirées, ces détails disparaissent. Le contraste à travers l'échantillon est brillant d'un côté et plus sombre de l'autre. Cela donne l'impression d'une topographie, mais en réalité, il s'agit d'une illusion.
Le sens de l'effet de projection d'ombre peut être inversé en tournant le polariseur au-delà d'un point de croisement jusqu'au contraste opposé. Nous venons de passer en revue les modes optiques de contraste de phase et de contraste interférentiel (DIC). Pour vous rappeler, l'élimination du contraste de phase accentue les spécimens contrastés du noir au blanc et s'avère utile pour observer des spécimens incolores et transparents.
Le DIC produit également un contraste dans l'échantillon. Il crée une image haute résolution d'une coupe optique fine. Voilà tout.
Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre microscopie.
Aperçu
Ce protocole met en évidence les principes et les applications pratiques de la microscopie en contraste de phase et en contraste interférentiel différentiel (DIC). Ces techniques améliorent la visualisation des spécimens biologiques transparents et incolores, ce qui en fait des outils essentiels en recherche biomédicale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche biomédicale
- Techniques de microscopie
- Imagerie optique
Contexte
- La microscopie optique est essentielle pour l'observation des échantillons biologiques.
- La microscopie en contraste de phase améliore le contraste des échantillons transparents.
- La microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) fournit des images haute résolution des structures fines.
- Ces deux techniques sont indispensables à une analyse efficace des échantillons.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'utilisation de la microscopie en contraste de phase et en contraste interférentiel différentiel (DIC).
- Expliquer la configuration et l'alignement des techniques de microscopie.
- Mettre en évidence les avantages de ces méthodes pour l'observation de matériaux biologiques.
Méthodes utilisées
- Mise en place de l'éclairage de Köhler pour une distribution optimale de la lumière.
- Utilisation d'objectifs et d'anneaux de contraste de phase.
- Mise en œuvre de l'optique DIC, incluant des polariseurs et des prismes diviseurs de faisceau.
- Comparaison de la visibilité des échantillons selon différentes techniques de microscopie.
Résultats principaux
- La microscopie en contraste de phase révèle les structures cellulaires dans les échantillons transparents.
- La microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) met en évidence les détails fins et confère un effet topographique.
- Les deux techniques améliorent considérablement la clarté des échantillons biologiques.
- Les artéfacts tels que les halos en contraste de phase sont mentionnés et expliqués.
Conclusions
- Le contraste de phase est efficace pour l'observation d'échantillons incolores et transparents.
- La microscopie en contraste interférentiel différentiel (DIC) permet une imagerie haute résolution des structures fines.
- Ces deux méthodes sont précieuses pour faire progresser la recherche en sciences biologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microscopie en contraste de phase et en contraste interférentiel différentiel (DIC) permet la visualisation d'échantillons biologiques transparents et non absorbants, soutenant les flux de travail de découverte précoce nécessitant un marquage sans coloration. Ces techniques réduisent les risques mécanistiques en révélant les détails structuraux et la morphologie fonctionnelle dans des cellules et tissus vivants, sans fixation ni coloration. Leur intégration dans les chaînes de découverte améliore la confiance dans la validation des cibles en permettant l'observation directe des réponses phénotypiques et de l'architecture cellulaire dans des conditions proches des conditions physiologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'observation sans marquage de spécimens transparents tels que les cellules vivantes et les coupes de tissus, afin d'évaluer les modifications morphologiques liées à la modulation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Facilite le criblage rapide de phénotypes cellulaires sans nécessiter de marqueurs fluorescents ni de fixation chimique, réduisant ainsi le temps de préparation des tests.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les hypothèses concernant la cible en permettant la visualisation directe de phénotypes structuraux et fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une imagerie sans marquage et à fort contraste, adaptée au développement de tests phénotypiques où la transparence masque les détails en champ clair.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation des conditions d'imagerie grâce à l'illumination de Köhler et à l'alignement précis des plaques de phase ou des prismes DIC, améliorant ainsi la reproductibilité entre les expériences.
- Extensibilité : Compatible avec les formats de plaques multi-puits lorsqu'elle est intégrée à des systèmes de microscopie automatisés, prenant en charge des campagnes de criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les étapes précliniques en permettant une imagerie cohérente des cellules primaires, des explants et des modèles d'embryons au sein de différents flux de travail.
- Réduction des risques mécanistiques : Met en évidence des détails structuraux fins aux interfaces tissulaires, aidant à clarifier les mécanismes d'action dans des systèmes biologiques complexes.
- Systèmes pertinents pour les maladies : Applicable à des échantillons épais, notamment des sections tissulaires, des œufs et des embryons, soutenant l'évaluation dans des modèles physiologiquement complexes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La microscopie à contraste de phase et la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) fonctionnent comme des technologies facilitatrices dans le continuum de la découverte, soutenant la vérification d'hypothèses en biologie fondamentale, la préparation de tests en criblage et l'analyse morphologique en recherche translationnelle.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant l'observation directe des réponses cellulaires à des perturbations sur des échantillons transparents et non colorés.
- Triage : Soutient le développement de tests grâce à une imagerie reproductible et à fort contraste d'échantillons sans marquage, réduisant ainsi la variabilité des lectures phénotypiques.
- Analyse : Génère des mesures quantitatives d'intensité et de contraste aux interfaces structurales, permettant une comparaison objective des conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité en offrant une visualisation constante des tissus primaires et des explants, de la découverte jusqu'à la validation préclinique.
- Réutilisation interdépartementale : Représente une capacité d'imagerie réutilisable à travers différents départements, réduisant les redondances dans l'allocation des ressources en microscopie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en révélant des détails structuraux fins et des caractéristiques topologiques chez des spécimens vivants non colorés.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation grâce à des procédures d'alignement définies pour les anneaux de phase et l'optique CIN, améliorant ainsi la reproductibilité au quotidien.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en renforçant la confiance dans les observations phénotypiques, réduisant ainsi l'élimination en phase avancée due à une complexité biologique inattendue.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des preuves phénotypiques directes et sans marquage provenant de systèmes pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en alignement optique, notamment en ce qui concerne l'éclairage de Köhler et le centrage précis des plaques de phase ou des prismes DIC.
- Dépend de matériel spécialisé : objectifs de contraste de phase équipés d'anneaux de phase, anneaux de condenseur, polariseurs, prismes de division et de combinaison du faisceau, ainsi que des analyseurs.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'éclairage et d'alignement afin d'assurer des résultats cohérents entre utilisateurs et sites.
- Les considérations d'adaptation incluent l'ajustement des indices de réfraction et l'épaisseur de l'échantillon, qui influencent la qualité de sectionnement en contraste interférentiel (DIC) et les artefacts de halo en contraste de phase.
- Les limitations pratiques comprennent les artefacts de halo en contraste de phase, qui peuvent masquer les structures fines, ainsi que l'effet d'ombre directionnel en DIC, une illusion d'optique ne reflétant pas une véritable topographie.
