ספקטרומטריית מסה טנדם

ספקטרומטריית מסה טנדם מקשרת בין מספר שלבים של ספקטרומטריית מסה כדי לבודד תחילה ביומולקולה, ולאחר מכן לקבוע היבטים של ההרכב הכימי שלה. לביומולקולות יש מבנים גדולים ומורכבים, מה שמקשה על קביעת ההרכב המולקולרי שלהן. ספקטרומטריית מסה טנדם בוחרת מולקולה מעניינת שמאוחר יותר מפוצלת למספר יחידות משנה, מה שיכול לעזור להבהיר את הזיהוי והרצף שלה. סרטון זה יציג את המושגים של ספקטרומטריית מסה טנדם, הליך כללי וחלק מהשימושים שלו בביוכימיה.

ספקטרומטריית מסה טנדם מתחילה כמכשיר מפרט מסה טיפוסי: עם מקור יונים, הממיר את הדגימה ליונים, ומנתח מסה, המפריד בין היונים על סמך יחס המסה למטען שלהם. מנתח מסה נפוץ, הקוואדרופול, מאפשר רק יונים עם יחס ספציפי לעבור, בעוד האחרים מתנגשים במוטות המנגנון. המין שמותר לעבור, שנקרא יון מבשר, הוא הביו-מולקולה המעניינת. היון נע לתוך תא התנגשות, בדרך כלל מרובע אחר, שבו מופעלת אנרגיה כדי לפצל את היון בתבנית צפויה.

שברים אלה עוברים למנתח מסה אחר, כגון זמן טיסה, המפריד בין "יוני המוצר" הללו. יוני המוצר נשלחים לאחר מכן לגלאי, כמו במכשיר MS רגיל. במקרה של חלבון לא ידוע, הספקטרום המתקבל מכיל שברים חופפים רבים, מה שמקשה על יצירת רצף שלם סופי של הביו-מולקולה. עם זאת, הדפוס הספקטרלי ייחודי לחלבון נתון. תוכנת ניתוח משווה את הספקטרום למסד נתונים של רצפי פפטידים ידועים, ומבהירה את החלבון הלא ידוע מהשברים החופפים.

בהתאם למדגם ולמידת הפיצול הרצויה, אפשריות שיטות פיצול מרובות. דפוסי פיצול תלויים באופן העברת האנרגיה, בכמותה ובאופן שבו היא מופצת דרך יון המבשר. אנרגיה יכולה להיות מועברת באמצעות חלקיקים ניטרליים, קרינה או אלקטרונים. באמצעות אטומים ניטרליים, תהליך הנקרא דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות או CID, מתפצל בעיקר בקשר הפפטידי בין חומצות האמינו, אידיאלי לזיהוין.

כעת, לאחר שכוסו יסודות הטכניקה, בואו נסתכל על ספקטרומטריית מסה טנדם של CID המשמשת לחקר מרכיב של מעטפות תאים חיידקיות.

כמו בכל הניסויים בספקטרומטריית מסה, הצעד הראשון הוא יינון הדגימה. עבור ביומולקולות, זה נעשה בדרך כלל באמצעות ספיגה בלייזר בעזרת מטריצה או יינון אלקטרו-ספריי. לאחר מכן ממוטב אות היונים המבשר על ידי כוונון אופטיקת היונים. לאחר שתסיים, המטרה מבודדת ושיטת הפיצול נבחרת, כגון CID.

חוזק המתח המופעל, המאיץ את יון המבשר לתא ההתנגשות, משפיע על מידת הפיצול. מתח זה מוגבר עד שהמבשר הוא בערך 10% שפע בהשוואה ליון המוצר הגבוה ביותר. ספקטרומים מרובים נרכשים ומחושבים בממוצע עד להשגת יחס אות לרעש מספיק. מספר הסריקות הדרושות תלוי בעוצמת האות של יון המבשר המקורי ויכול לנוע בין 3 ל-300.

לאנליט בדוגמה זו, ליפיד A מ-Escherichia coli K-12, היו 19 שברים עיקריים לאחר CID. המבנה הכללי של ליפיד A ידוע היטב, ומאפשר לתוכנה לשחזר את ההרכב הספציפי מהדגימה.

כעת, לאחר שבדקנו את ההליך, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה טנדם בביוכימיה.

מצב סריקה נפוץ בספקטרומטריית מסה טנדם הוא ניטור תגובה נבחר, או SRM. ב-SRM, שני מנתחי המסה קבועים ליחס מסה למטען נבחר, תוך התמקדות במבשר ספציפי וביוני תוצר. בגלל מידת הרגישות הגבוהה של SRM, ניתן להשתמש בספקטרום תקני הפפטידים בריכוז ידוע ולהשוות אותו לזה של הדגימות הלא ידועות, מה שמאפשר לכמת חלבונים מעניינים.

חלבונים משתנים בדרך כלל לאחר התרגום, בדרך כלל על ידי הוספת קבוצות פונקציונליות כגון קבוצות מתיל, קבוצות פוספט או סוכרים, הידועים בשם גליקנים. אלה חשובים בתהליכי איתות תאים, ומבהירים כיצד תאים מתקשרים זה עם זה. מכיוון שספקטרומטריית מסה טנדם מפצלת את החלבונים לרכיבים קטנים יותר, ניתן לקבוע את מיקום ה- PTM לשבר הספציפי או אפילו לחומצת אמינו. שינויים מסוימים, כגון אצטילציה וטרימתילציה, קשה להבדיל לפי מסה בלבד, ולכן הפרדה כרומטוגרפית מתבצעת לפני ספקטרומטריית המסה.

אנליטים רבים בדם המטופל נמצאים בריכוזים מתחת לגבול הזיהוי עבור ספקטרומטריית מסה טיפוסית. יתרון נוסף של SRM הוא שהוא משליך את כל יון המוצר מלבד אחד, מגדיל את הרגישות ומשפר את גבול הזיהוי התחתון עד פי 100. בדוגמה זו, ניתן לזהות את התרופה המדכאת את מערכת החיסון, טקרולימוס, ברמות של 1 ננוגרם/מ"ל.

זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על ספקטרומטריית מסה טנדם. סרטון זה תיאר את התיאוריה של הכלי, עבר על נוהל כללי והסביר כמה מהדרכים שבהן הטכניקה משמשת כיום. תודה שצפית!