Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

במצגת זו, נציג מערכת זלוף עפעפיים מבוססת מיקרופלואידית למדידה סימולטנית של הפרשת אינסולין דינמית, זרימת סידן ושינויים פוטנציאליים מיטוכונדריאלים של לולאות הלבלב בתגובה לכלבים המפרישים אינסולין. מערכת הזלוף מורכבת ממכשיר מיקרופלואידית תלת שכבתי, משאבות מזרק ואינסולין קולט שברים. הפרשות המושרות זרם סידן ופוטנציאל מיטוכונדריאלי מצולמים באמצעות מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

היי, שמי אולה, וולר מהמעבדה של ד"ר ואל הולטר במחלקה לניתוחי השתלות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. היי, אני דון לי, גם הוא מהמעבדה של אוקטובר. היי, אני טרישה הארט, גם היא מהמעבדה של Dr.Al הולסטר.

היום נראה לך הליך להדמיית עפעפיים בו זמנית באמצעות שיפוע גלוקוז ליניארי. השתמשנו בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הוויזואליה והתפקוד של העפעפיים. אז בואו נתחיל.

המכשיר המיקרופלואידי המשמש להליך זה מורכב משלוש שכבות של PDMS מרפאים שנוצרו על ידי פוטוליתוגרפיה סטנדרטית. השכבה הראשונה שנוצרת ממאסטר סיליקון כוללת את הבארות של המכשיר המיקרופלואידי שיחזיקו בעדינות את הלולאות במקומן, בעומק 150 מיקרומטר ובקוטר 500 מיקרומטר. לשכבה השנייה יש תעלות בגובה 500 מיקרומטר ורוחב שני מילימטרים.

אמצע התעלה מורחב כדי לפזר את הזרימה להחלפה טובה יותר של תמיסה בתוך המכשיר, בתמורה נעשה היטב על ידי ניקוב חור בגובה שלושה מילימטרים ורוחב שבעה מילימטרים באמצע השכבה. השכבה השלישית היא לוח עבה של PDMS. להכנת שכבה זו יש לנקב חורים קטנים משני הצדדים המתאימים לכניסה ויציאת התעלה.

בשכבה השנייה, לאחר שנוצרו כל שלוש השכבות, השכבה הראשונה מחוברת למגלשת זכוכית כשהבארות פונות כלפי מעלה. לאחר מכן השכבה השנייה מודבקת לשכבה הראשונה כשמרווח הערוצים כלפי מעלה. לבסוף, השכבה השלישית מחוברת לשכבה השנייה.

לאחר חיבור השכבות, המכשיר מוכן לשימוש לניסויים. באמצעות מזרק של 10 מיליליטר מלא ב-70% אתנול ומחובר ליציאת הכניסה של המכשיר עם Tai על צינור, עקר את המכשיר המיקרופלואידית על ידי הזרמת האתנול דרך תעלות המכשיר. לאחר מכן באמצעות אותה זרימת התקנה, מים נטולי יונים כדי לשטוף את האתנול.

לאחר עיקור המכשיר, הנח אותו על במת מיקרוסקופ מחוממת באמצעות צינורות טיגון, חבר את משאבות המזרק המכילות תמיסות גלוקוז גבוהות ונמוכות למחבר Y. לאחר מכן התחבר לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. חבר את השקע של המכשיר המיקרופלואידי לקולט שברים.

ודא שהצינור מונח על פלטה חמה של 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד לשמור על התמיסות בטמפרטורה פיזיולוגית לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, השתמש בתוכנית תצוגת המעבדה כדי ליזום את שיפוע הגלוקוז שיוחדר דרך הרשת המיקרופלואידית במהלך הניסוי.

תוכנה זו משנה את קצב הזרימה של שתי תמיסות גלוקוז. על ידי שליטה במשאבות המזרק, ניתן ליצור כאן פרופילי שיפוע גלוקוז שונים, פרופילי שיפוע גלוקוז ליניאריים, בצורת פעמון ובצורת ריבוע. בהשוואה לערכים הצפויים המחושבים המוצגים בניסוי זה, השיפוע הליניארי של שני מילי-מולרי עד 25 מילי-מולרי גלוקוז ישמש עם קצב זרימה משתנה של 0.01 מיליליטר לדקה של שתי תמיסות הגלוקוז וקצב זרימה קבוע של 0.25 מיליליטר לדקה הנכנס למכשיר לאחר ערבוב התמיסות.

לאחר בחירת פרופיל השיפוע המתאים, בדוק את יציבות השיפוע. תחילה, הפעל את מערכת השיפוע. לאחר מכן הפעל את אספן השברים ואסוף שמונה במיליליטר אחד צינורות אורף.

לאחר מכן באמצעות גלוקומטר, בדוק את ריכוז הגלוקוז בכל צינור באמצעות אקסל. נתח את התוצאות המתקבלות מהגלוקומטר. לאחר מכן, החלף את מזרק הגלוקוז הגבוה במזרק המכיל תמיסת BSA של 0.5% במאגר הצלצול של קרבס PERFUSE 50 מיליליטר דרך המכשיר בקצב של מיליליטר אחד לדקה.

זה ימנע ספיגה לא ספציפית של אינסולין לדפנות המיקרו-ערוץ כדי להבטיח דיוק בעת מדידה מאוחרת יותר של רמות האינסולין המופרשות לאחר זלוף עם BSA. החלף אותו בתמיסת הגלוקוז הגבוהה ראוס. השעו 25 עד 30 לולאות עכבר שנבחרו ביד במאגר קרבס רינגר של שני מילי-מולארי גלוקוז המכיל את צבע מחוון הסידן 2:00 לפנות בוקר ואת מחוון הפוטנציאלים המיטוכונדריאלי צבע רומין 1 2 3, דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, נתק את המכשיר ממערכת הזלוף וטען בזהירות את הלולאות למכשיר המיקרופלואידי על ידי הכנסת קצה הפיפטה, המכיל את האיים לפתח הכניסה, וחלוקה איטית של האיים לאחר הטעינה, חבר מחדש את המכשיר למערכת הזלוף. היזהר לא להכניס בועות. לאחר מכן, הפעל את משאבת המזרק כדי להתחיל לחלחל את הלולאות עם KRB המכיל שני גלוקוז מילימולרי.

שלב זה ישטוף את עודפי הצבע מהמדיום, ייעד את ערכות מסנני העירור והפליטה וזמני החשיפה שישמשו במהלך הניסוי. לאחר מכן הגדר את אספן השברים לאסוף במרווחי זמן של דקה אחת תוך שימוש בלולאות עם תמיסת הגלוקוז הנמוכה. השתמש באזור העניין או בכלי ההחזר על ההשקעה של תוכנת ההדמיה הפשוטה PCI כדי להגדיר את האזורים או הלולאות שברצונך לצלם.

כמו כן, הקיפו את אזור הרקע שיופחת לאחר שטיפת התאים במשך 10 דקות, הפעילו את אספן שבר שיפוע הגלוקוז והתחילו הדמיית זמן-lapse. לאחר 30 דקות, כבה את התוכנה ואת משאבת המזרק עם גלוקוז גבוה. המשיכו לחלחל עם גלוקוז נמוך כדי לשטוף את השפעת הגלוקוז הגבוה.

לאחר 10 דקות, עצרו את זרימת הגלוקוז הנמוך על ידי כיבוי משאבת המזרק. לאחר הזילוף, ייצא את הנתונים לאקסל לצורך ניתוח. ניתן לקבוע את כמות האינסולין המופרש לתוך הפרפו שמונה על ידי לולאות עכבר ELA.

הוחדרו עם שיפוע ליניארי של 2 עד 25 מילי-מולרי גלוקוז כפי שמוצג כאן. זרם סידן והפרשת אינסולין מופעלים לאחר כ-13 דקות של זלוף המתאים ל-6 מילי-מולאר. גלוקוז. שינויים בפוטנציאל המיטוכונדריה נראים מוקדם יותר, כצפוי לאחר כ-11 דקות.

נתונים אלה מדגימים את היתרון בשימוש ברשת מיקרופלואידית זו לאפיון פיזיולוגיה של לולאות. זה עתה הראינו לך כיצד להשתמש במכשיר ההיתוך המיקרופלואידי שלנו לחקר הפיזיולוגיה של העפעפיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לוודא שאין בועות במכשיר, מכיוון שהדבר עלול לגרום ללולאות לזוז במהלך ניסוי.

כמו כן, ניתן לכוונן את הפלורי עד מ"ל אחד לדקה מבלי להפריע ללולאות. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.