Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic
26 בינואר 2010
המכשיר microfluidic perifusion איון פותחה להערכת הפרשת אינסולין הדינמי של איים רבים דימות פלואורסצנטי סימולטני של זרם סידן שינויים אפשריים המיטוכונדריה.
במצגת זו, נציג מערכת פרפוזיה (perfusion) מבוססת מיקרופלואידיקה למדידה בו-זמנית של הפרשת אינסולין דינמית, זרימת סידן ושינויים בפוטנציאל מיטוכונדריאלי של אי-לבלב בתגובה למעוררי הפרשת אינסולין. מערכת הפרפוזיה מורכבת מהתקן מיקרופלואידי תלת-שכבתי, משאבות מזרק ואספן פרקציות. זרימת סידן ופוטנציאלים מיטוכונדריאליים שנוערו על ידי מעוררי הפרשת אינסולין מדוממים באמצעות מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
שלום, שמי אולה, חוקרת מהמעבדה של ד"ר Val Holter במחלקה לכירורגיית השתקפות באוניברסיטה של אילינוי בשיקגו. שלום, אני דון לי, גם מהמעבדה של ד"ר Holter. שלום, אני טרישיה הארט, גם מהמעבדה של ד"ר Holter.
היום נציג בפניכם פרוצדורה לדימות סימולטני של עפעפיים באמצעות מדרג ריכוזים ליניארי של גלוקוז. השתמשנו בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את המבנה הוויזואלי והתפקוד של העפעפיים. בואו נתחיל.
ההתקן המיקרופלואידי המשמש להליך זה מורכב משלוש שכבות של PDMS מאובה, שיוצרו באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית. השכבה הראשונה, שיוצרה מתבנית סיליקון, כוללת את בארות ההתקן המיקרופלואידי שיחזיקו בעדינות את הלולאות במקומן, בעומק של 150 micrometers ובקוטר של 500 micrometers. השכבה השנייה כוללת תעלות בגובה של 500 micrometers וברוחב של two millimeters.
מרכז התעלה מורחב כדי לפזר את הזרימה למען חילוף יעיל יותר של התמיסה. בתוך המכשיר, באר החילוף נוצרת על ידי ניקוב חור בגובה שלושה מילימטרים וברוחב שבעה מילימטרים במרכז השכבה. השכבה השלישית היא לוח עבה של PDMS. כדי להכין שכבה זו, נקבו חורים קטנים בשני הצדדים המיושרים עם הכניסה והיציאה של התעלה.
בשכבה השנייה, לאחר שכל שלוש השכבות נוצרו, השכבה הראשונה מודבקת למסליית זכוכית כאשר הבארות פונות כלפי מעלה. לאחר מכן, השכבה השנייה מודבקת לשכבה הראשונה כאשר המרווחים בין התעלות פונים כלפי מעלה. לבסוף, השכבה השלישית מודבקת לשכבה השנייה.
לאחר חיבור השכבות, המכשיר מוכן לשימוש בניסויים. השתמש במזרק של 10 milliliter מלא ב-70% ethanol המחובר לפתח הכניסה של המכשיר באמצעות צינורית Tai, וכבסטר את המכשיר המיקרופלואידי על ידי זרימת ה-ethanol בערוצי המכשיר. לאחר מכן, באמצעות אותה מערכה, העבר מים דה-יוניים (deionized water) כדי לשטוף את ה-ethanol.
לאחר עיקור המכשיר, מקמו אותו על במה של מיקרוסקופ מחוממת באמצעות צינורות טיגון (tigon), וחברו את משאבות המזרקים המכילות תמיסות גלוקוז בריכוז גבוה ונמוך למחבר Y. לאחר מכן, חברו אותן לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. חברו את היציאה של המכשיר המיקרופלואידי לאסוף פראקציות (fraction collector).
יש לוודא שהפיתוחית מונחת על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 37 °C. חשוב מאוד לשמור על התמיסות בטמפרטורה פיזיולוגית לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, השתמש בתוכנת ה-lab view כדי להתחיל את הזרמת מדרגת הגלוקוז שתחלחל דרך הרשת המיקרופלואידית במהלך הניסוי.
תוכנה זו משנה את קצב הזרימה של שני תמיסות גלוקוז. באמצעות בקרת משאבות המזרקים, ניתן ליצור כאן פרופילי מדרג גלוקוז שונים: פרופילי מדרג גלוקוז ליניאריים, בצורת פעמון ובצורת מלבן. בניגוד לערכים הצפויים שחושבו ומוצגים בניסוי זה, נעשה שימוש במדרג ליניארי של 2 millimolar עד 25 millimolar גלוקוז עם קצב זרימה משתנה של 0.01 milliliters per minute של שתי תמיסות הגלוקוז וקצב זרימה קבוע של 0.25 milliliters per minute הנכנס למכשיר לאחר ערבוב התמיסות.
לאחר בחירת פרופיל המדרג המתאים, יש לבחון את יציבות המדרג. ראשית, הפעל את מערכת המדרג. לאחר מכן, הפעל את אספן הפרקציות ואסוף שמונה פרקציות של 1 mL לשפופרות Eppendorf.
לאחר מכן, בעזרת גלוקומטר, בדקו את ריכוז הגלוקוז בכל מבחנה ורשמו את הנתונים ב-excel. נתחו את התוצאות שהתקבלו מהגלוקומטר. לאחר מכן, החליפו את מזרק הגלוקוז בריכוז גבוה במזרק המכיל תמיסת 0.5%BSA בבופר Krebs ringer, ובצעו PERFUSE של 50 milliliters דרך המכשיר בקצב של מיליליטר אחד לדקה.
פעולה זו תמנע ספיגה לא ספציפית של אינסולין לדפנות המיקרו-תעלה כדי להבטיח דיוק במדידה מאוחרת של רמות אינסולין מופרש לאחר פרפוזיה עם BSA. החליפו זאת בתמיסת גלוקוז בריכוז גבוה reus. השעו 25 עד 30 איליס (eyelets) של עכבר שנבחרו ידנית בבופר Krebs ringer עם גלוקוז בריכוז 2 mM, המכיל את צבע האינדיקטור לסידן fira 2:00 AM ואת צבע האינדיקטור לפוטנציאל המיטוכונדריאלי rumine 1 2 3, והדגרירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר הדגירה, נתק את המכשיר ממערכת הפרופוזיה וטען בזהירות את האיליטים (eyelets) לתוך המכשיר המיקרופלואידי על ידי הכנסת קצה הפיפטה, המכילה את האיליטים, לתוך פתח הכניסה. לאחר הפצת האיליטים באיטיות, חבר מחדש את המכשיר למערכת הפרופוזיה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר. לאחר מכן, הפעל את משאבת המזרק כדי להתחיל בביצוע פרופוזיה לאיליטים באמצעות KRB המכיל 2 mM גלוקוז.
שלב זה ישטוף את עודפי הצבע מהתווך, ויגדיר את סטי הפילטרים של העירור והפליטה ואת זמני החשיפה שבהם ייעשה שימוש במהלך הניסוי. לאחר מכן, הגדירו את אספן הפракציות לאסוף במרווחי זמן של דקה אחת בזמן שימוש בפתחי העין עם תמיסת הגלוקוז בריכוז נמוך. השתמשו בכלי ה-region of interest או בכלי ה-ROI מתוך תוכנת הדימוי הפשוטה של ה-PCI כדי להגדיר את האזורים או את פתחי העין שברצונכם לדגום.
בנוסף, סמנו במעגל את אזור הרקע שיסורק לאחר שטיפת התאים למשך 10 דקות, הפעילו את אספן השברים של מדרגת הגלוקוז והתחילו בצילום time-lapse. לאחר 30 דקות, כבו את התוכנה ואת משאבת המזרקים של הגלוקוז בריכוז גבוה. המשיכו בביצוע פרפוזיה עם גלוקוז בריכוז נמוך כדי לשטוף את השפעת הגלוקוז בריכוז הגבוה.
לאחר 10 דקות, הפסיקו את זרימת הגלוקוז בריכוז נמוך על ידי כיבוי משאבת המזרקים. לאחר הפרפוזיה, ייצאו את הנתונים לקובץ excel לצורך ניתוח. ניתן לקבוע את כמות האינסולין שההפרישה לתוך תמיסת הפרפוזיה באמצעות ELISA למספרים של עכברים.
בוצעו פירפוסיה עם מדרג ליניארי של 2 עד 25 מילימולר גלוקוז, כפי שמוצג כאן. כניסת סידן והפרשת אינסולין מופעלות לאחר כ-13 דקות של פירפוסיה, המתאימות ל-6 מילימולר גלוקוז. שינויים בפוטנציאל המיטוכונדריאלי נצפים מוקדם יותר, כצפוי, לאחר כ-11 דקות.
נתונים אלו מדגימים את היתרון שבשימוש ברשת מיקרופלואידית זו לאפיון הפיזיולוגיה של eyelets. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשתמש במכשיר הפרה-פוזיה המיקרופלואידי שלנו למחקר של פיזיולוגיה של eyelets. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שאין בועות במכשיר, שכן הדבר עלול לגרום לתזוזת ה-eyelets במהלך הניסוי.
בנוסף, ניתן להתאים את קצב הזרימה עד ל-1 ml לדקה מבלי להפריע ללולאות. זהו, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג התקן מיקרופלואידי לפריפוזיה של איים (islets), שתוכנן להערכה דינמית של הפרשת אינסולין ממספר איים. ההתקן מאפשר דימוי פלואורסצנטי סימולטני של זרימת סידן ושינויים בפוטנציאל המיטוכונדריאלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- הפרשת אינסולין דינמית היא קריטית להבנת תפקוד הלבלב.
- זרימת סידן פנימה ופוטנציאל מיטוכונדריאלי הם מדדים מרכזיים לפעילות תאי האיים.
- התקני מיקרופלואידיקה מאפשרים בקרה מדויקת על תנאי הניסוי.
- דימות פלואורסצנציה מספק תובנות בזמן אמת לגבי תהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת מיקרופלואידיקה להערכת דינמיקת הפרשת אינסולין.
- מתן אפשרות למדידה סימולטנית של שינויים בסידן ובמיטוכונדריה.
- שיפור ההבנה של תגובות תאי האיים לסקרטגוגים (secretagogues).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של התקן מיקרופלואידי בעל שלוש שכבות.
- שימוש במשאבות מזרק לצורך פירפוזיה מבוקרת.
- הטמעת אספן פרקציות לאיסוף דגימות.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיית תגובות תאיות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של הפרשת אינסולין דינמית מאיים.
- תצפית על זרימת סידן פנימה בתגובה למעוררי הפרשה (secretagogues).
- הערכה של שינויים בפוטנציאל המיטוכונדריאלי במהלך הניסויים.
- הדגמה של יעילות ההתקן המיקרופלואידי בניתוח בזמן אמת.
מסקנות
- מכשיר הפריפוזיה המיקרופלואידי לאיי לבלב יעיל לחקר דינמיקת האינסולין.
- דימות סימולטני מספק תובנות בעלות ערך לגבי הפיזיולוגיה של תאי האיים.
- גישה זו יכולה לקדם את המחקר בסוכרת ובהפרעות מטבוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת פריפוזיה מיקרופלואידית זו מאפשרת הערכה רב-פרמטרית בזמן אמת של תפקוד איים בלב অগניקיאס (pancreatic islets), ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים במחקר על סוכרת. באמצעות שילוב של מדידות דינמיות של הפרשת אינסולין עם דימיון של סידן ופוטנציאל מיטוכונדריאלי, הפלטפורמה משפרת את הפחתת הסיכונים המכניסטית של מועמדים תרפויטיים. המערכת מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, המשפרים את הביטחון החזותי בזיהוי מובילים (lead identification) ובקידום פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מתאם בין הדינמיקה של הפרשת אינסולין לבין זרימת סידן ותגובות מיטוכונדריאליות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות קריאות סימולטניות, ללא סימון (label-free), של מסלולים פיזיולוגיים מרכזיים.
- ערך חיזוי: משפר את מיון הפורטפוליו על ידי אספקת קריאות תפקודיות מוקדמות ורב-פרמטריות המפחיתות עמימות מכניסטית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך על ידי סטנדרטיזציה של הטיפול באיי לבלבל ותנאי הפרפוזיה.
- שחזוריות: הבטחת אספקה עקבית של מדרגות גלוקוז ואיסוף דגימות באמצעות פרקציונטור, המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): תמיכה בניתוח מרובה (multiplexed) של איי לבלבל בתוך מכשיר בודד, להגברת התפוקה לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי למסלולי העבודה הפרה-קליניים על ידי שמירה על פרופילי גירוי גלוקוז הרלוונטיים למחלה.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נתונים תפקודיים ארוכי טווח התומכים בהחלטות go/no-go בהתקדמות הפרה-קלינית.
- סנכרון ביומרקרים: מקל על ביסוס קורלציה בין הפרשת אינסולין לבין ביומרקרים של סידן ומטוכונדריה לצורך הבנה מכניסטית.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
המערכת משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך מאפשרת ניטור תפקודי רציף של תגובות האיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי קישור חשיפה לסקרטגוג (secretagogue) לתגובות מטבוליות בזמן אמת.
- סקרנינג: מספק תכונות של איים (islets) הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, עם פלטים מדידים לסקרנינג של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר נתוני אינסולין, סידן ומטוכונדריה מוגדרי-זמן המאפשרים ניתוח השוואתי של תנאים וקביעת EC50.
- מחקר תרגומי: שומר על רלוונטיות פיזיולוגית באמצעות מדרגי גלוקוז דינמיים המדמים דפוסי גירוי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקות איטרטיביות על פני סדרות תרכובות רבות ומודלים גנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באמצעות קריאות תפקודיות רב-פרמטריות בזמן אמת המפחיתות תוצאות חיוביות שגויות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות פרפוזיה מבוקרת, דגימה מקוטעת ויצירה אוטומטית של מדרג ריכוזים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מועמדים לפני מחקרים יקרים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת יעילות תפקודית ותובנה מכניסטית במקביל.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בהתקני מיקרופלואידיקה, במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמערכות פרפוזיה של גלוקוז.
- תלוי במשאבות מזרק, באספנים של פרקציות ובבקרה סביבתית (37°C) לצורך רלוונטיות פיזיולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת האיים, טעינת צבע ובחירת ROI לצורך דימוי עקבי.
- כולל שיקולי התאמה למקורות שונים של איים (עכבר, בן אדם) ולצבעי אינדיקטור.
- מוגבל על ידי טעינה ידנית של איים והסתייגות מהיווצרות בועות, שעלולות לשבש את הפרפוזיה ואת הדימוי.
