Name: אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: חקור את שיטת ה-tomography קריואלקטרוני לתאים חיידקיים באמצעות טכניקות הקפאה בזריקה והקפאה בלחץ גבוה. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מבנים תוך-תאיים בקרבת מצבם הטבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI067548 R01, R01 GM081520, GM086200 R01, R01 AI049194 ו P01 GM066521 כדי GJJ כמו גם את הווארד יוז רפואי במכון, במכון Beckman בקלטק, מתנות קלטק מן גורדון ובטי מור קרן Agouron המכון. MSL נתמך על ידי מענק 2R37-NIH A1041239-06A1 על פמלה ס ביורקמן. לייקה מיקרוסיסטמס חביב בתנאי תוכן וידאו של אוסף cryosection. תוצאות נציג Treponema primitia נאספו ועובדו על גאווין א מרפי, ופורסם למיקרוביולוגיה מולקולרית עם הכותרת &quot;ultrastructures רומן של Treponema primitia והשלכותיהם על תנועתיות&quot;. (מרפי, G. et al. מול. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים במאמר זה וידאו איך לעשות ECT של תאים חיידקיים. מוגבלת על ידי מרחב וזמן, אנחנו רק להראות את פרוטוקול כללי. פרטים נוספים ניתן למצוא מאמרים, מידע מקוון או אחרים הניתנים על ידי מייצרת הציוד ומפתחי תוכנה, מקבוצות מחקר ECT. בהתאם מינים שונים חיידקי למד, הציוד המשמש לבין האינטרס מבניים בתאים, את הפרוטוקול ואת הפרמטרים ניסיוני צריכים להיבדק אופטימיזציה.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>תמיסה של 0.1%</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קולואיד זהב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Bovine serum Albumin</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>נייר סינון Nr 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, MW 39000</td></tr><tr><td>Planchet עם כיפת פליז</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בלחץ גבוה Bal-Tec HPm 010</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום קריו-אולטרה UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיינן Static line II</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכולת שינוע יבשה CX100 Dry shipper</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תחנת טעינה MSH</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך Ti E/B</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>מותאם אישית</td></tr><tr><td>במת Cryo LM</td><td>FEI</td><td></td><td>מותאם אישית</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>עם UltraCam מבית Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אלקטרונים cryotomography של תאים חיידקיים

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

בעוד הרבה ידוע כבר על חילוף החומרים הבסיסי של תאים חיידקיים, שאלות יסוד רבים עדיין ללא מענה מפתיע, כולל למשל איך הם יוצרים ולשמור צורות תאים מסוימים, להקים קוטביות, לבודד הגנום שלהם, ומחלקים. על מנת להבין את התופעות האלה, טכנולוגיות הדמיה כי יש צורך לגשר על הפער בין ההחלטה מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי רזולוציה גבוהה יותר שיטות כגון קריסטלוגרפיה רנטגן ספקטרוסקופית NMR. אלקטרונים cryotomography (ECT) היא טכנולוגיה המתעוררים שעושה בדיוק את זה, המאפשר ultrastructure של תאים להיות דמיינו במצב כמעט טבעיות, בשלושה מימדים (3D), עם רזולוציה &quot;macromolecular&quot; (~ 4nm). 1, 2 ב ECT, התאים הם צילמו ב זגוגי, &quot;קפוא hydrated&quot; המדינה מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים cryo (cryoTEM) בטמפרטורה נמוכה (&lt;-180 ° C). עבור תאים דקים (עד ~ 500 ננומטר עובי 3), תאים שלמים הם לצלול קפוא בתוך רשתות התקשורת ברחבי EM ב cryogens כגון אתאן או אתאן / פרופאן תערובות. תאים עבה biofilms יכול להיות גם צילמו במצב זגוגי על ידי &quot;הקפאת בלחץ גבוה&quot; הראשון ולאחר מכן, &quot;cryo-חתך&quot; אותם. סדרה של דו מימדי תמונות הקרנת נאספים אז דרך המדגם כפי שהוא מוטה באופן הדרגתי לאורך אחד או שני צירים. שחזור תלת ממדי, או &quot;tomogram&quot; אז יכול להיות מחושב מן התמונות. בעוד ECT דורש מכשור יקר, בשנים האחרונות, זה נעשה שימוש במעבדות ספורות כדי לחשוף מבנים של איברים חיצוניים שונים, מבנים של מעטפות תאים שונים, עמדות ומבנים של סיבים cytoskeletal, ואת המיקומים של ארכיטקטורות macromolecular גדול מכלולים כגון מנועים flagellar, תאים פנימיים מערכים chemoreceptor. 1, 2 במאמר זה אנו וידאו להמחיש כיצד תאים התמונה עם ECT, כולל תהליכים של הכנת המדגם, איסוף נתונים, שחזור tomogram, ופרשנות של התוצאות באמצעות פילוח וגם מתאם במקרים מסוימים עם מיקרוסקופ אור.

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי &quot;macromolecular&quot; (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

בעוד שמידע רב כבר ידוע על המטבוליזם הבסיסי של תאי חיידקים, שאלות יסודיות רבות נותרו באופן מפתיע ללא מענה, כולל עבור...

בסרטון זה, תמונות תלת-ממדיות של תאי חיידקים במצב קרוב למצבם הטבעי ברזולוציה מולקולרית נוצרות באמצעות קריו-טומוגרפיה אלקטרונית. הדבר מושג תחילה על ידי הקפאה מהירה (plunge freezing) של תאים שלמים, או לחלופין, הקפאה בלחץ גבוה (high pressure freezing) וחיתוך קריוגני של משקעי התאים. סדרה של תמונות היטל נרכשת ומשמשת ליצירת שחזור תלת-ממדי, או טומוגרמה, אשר עוברת סגמנטציה וניתוח חישובי נוסף.שלום, אני גרנט ג'נסן מהחטיבה לביולוגיה ב-Caltech, ואיתי סוניה צ'ן שארגנה את המצגת שלנו. היום נראה לכם כיצד לבצע קריו-טומוגרפיה אלקטרונית של תאי חיידקים. בדרך כלל, אדם אחד יבצע את כל הפרוצדורה, אך מכיוון שהפרוטוקולים שלנו פותחו מתוך ניסיון משותף, נכלול את כל מי שעובד כעת במעבדה.בנוסף לסוניה וליי בווידאו, תראו את מייגן דוברו, אריאנה, ברי, מיגאל, אליסטר מקדואל, מארק רודינסקי וג'ן. חברי מעבדה נוספים הפקו את צילומי המסך ועזרו בהכנת הפרוטוקול הכתוב הנלווה, ביניהם מורגן בבה, מרטין פילר, ג'יין דינג, ג'ו לי, לו גאן, עליזה תובה ודילן מוריס. אריאנה תפתח את הסרטון ותדגים לכם כיצד אנו מבצעים הקפאה מהירה (plunge freeze) לתאי חיידקים.עבור תאים בקטריאליים דקים, תרחיף של תאים שלמים עובר הקפאה מהירה (plunge freezing) על גבי רשת EM. כאן מוצג התהליך באמצעות מכשיר הקפאה מהירה אוטומטי מסחרי; התחילו בבדיקת התרביות הבקטריאליות כדי לוודא שהן נקיות מזיהומים וניכרות בהן התמזגות או ריכוז מתאימים. בצעו פריקה חשמלית (glow discharge) לרשת EM מצופה פחמן למשך שתיים עד ארבע דקות. לאחר מכן, ערבבבו 100 µL של תמיסת זהב קולואידי עם 25 µL של תמיסת 5% BSA.סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-18,000 G למשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע הזהב (gold pellet). ב-20 µL של תמיסת תאים, הניחו את רשת ה-EM ב-Vitra bot בלחות של 100%.לאחר מכן, יש להניח ארבעה µL מתערובת התאים על רשת EM שעברה פריקה חשמלית (glow discharge). הרשת עוברת ספיגה אוטומטית משני צדדיה באמצעות נייר סינון כדי להסיר עודפי נוזל, ולאחר מכן נטבלת במהירות לתוך תערובת נוזלית של אתאן ופרופאן, המקוררת על ידי חנקן נוזלי. יש להוציא בזהירות את הרשת מתערובת האתאן-פרופאן ולהעבירה במהירות לקופסת אחסון רשתות הנשמרת בחנקן נוזלי. עבור תאים עבים יותר, הקפאה בלחץ גבוה מונעת התגבשות קרח.ביצוע חיתוך קריוסיקציוני (cryosectioning) לאחר מכן יספק דגימות דקות מספיק עבור em. ההדמיה מתחילה על ידי סבב צנטריפוגה של 15 milliliters של תאים במהירות של 1000 RPM למשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסיר את הנוזל העליון וערבב 0.5 milliliters מהמשקע של התרבית שנותר עם 0.5 milliliters של קריופרוטקטור דקסטרין בריכוז 20%.לאחר מכן, סנטריפוגה שוב במהירות של 13,000 RPM למשך 15 שניות. לאחר שהתאים שקעו למשקע, הסירו את הנוזל העליון והעבירו באמצעות פיפט 0.1 milliliter מהמשחה של המשקע לתוך טיפ של מיקרו-פיפט אטום תרמית, המכיל כבר 0.2 milliliters של 20%dextrin כחומר קריו-פרוטקטור. סנטריפוגה את התערובת בטיפ של המיקרו-פיפט במהירות של 13,000 RBM למשך 30 שניות.לאחר הסבוב, הסר את הנוזל העליון (supernatant). ניתן לראות משקע דחוס של 5 עד 10 µL בקצה האטום. העבר את העיסה לחצי כיפה של דיסקיות פליז מצופות טפלון בעלות צורה כיפתית, שכבר הותקנו בזרוע של מחזיק מקפיא הלחץ הגבוה, ולאחר מכן אטום באמצעות הכובע השטוח התואם העשוי פליז.לאחר מכן, הכניסו מיד את מכלול הזרוע למקפיא בלחץ גבוה שהוכן מראש. בלחץ של 2100 bar, יחידת הפלנצ'ט (planche) המשולבת מפירס, המכילה את התאים, מקוררת במהירות על ידי סילון של חנקן נוזלי בלחץ גבוה. לאחר קירור התאים, הוציאו במהירות את מכלול הזרוע וטבלו אותו מיד באמבט של חנקן נוזלי כדי למנוע את התחממות הפלנצ'ט.בשלב הבא, העבירו את הפלאנצ'טה למלחצי cryogenic microtome שקולו למלחציים ומוצב בבטחה בתא של ה-cryo microtome, כדי לחשוף את כיפת התאים הקפואה היטב לצורך חיתוך. את שתי פלטות הפליז מפרידים בזהירות תחת חנקן נוזלי. כיפת תאים קפואה באופן מושלם תיראה זכוכיתית ותהיה נקייה מסדקים ומחריצים של גרעיני קרח.באמצעות המיקרוטום הקריוגני, עצבו את אזור הכיפה החיצונית לשטח של פחות מ-0.2 square millimeters בעזרת כלי קיצוץ יהלום במהירות חיתוך מהירה; שמרו על עומק של כ-200 micrometer תוך התזת ספריי אנטי-סטטי לעבר הסכין בעלת הזווית הנמוכה ורשתות התמיכה מנחושת. בקרבה רבה, קרבו בזהירות את סכין היהלום אל פני הבלוק המלוטשים במהירות חיתוך של כ-0.4 millimeters per second ובחלון חיתוך צר. התחילו לחתוך פרוסות בעובי של 50 עד 350 nanometer.הנח בזהירות מורכי ריסונים עדין כדי לתפוס את החלקים הראשונים, תוך החלקה מקצה הסכין של יהלום בזווית נמוכה, כדי לתמוך ולהוביל את סרטי החיתוכים אל תמיכת רשת הנחושת. לאחר טעינת הרשת, השתמש במ probes כסף מלוטש ומקורר כדי ללחוץ בחוזקה על הסרטים. אחסן את הרשתות בקופסאות הרשתות בתוך מכולה למשלוח יבש (dry shipper) מקוררת בחנקן נוזלי עד שהמיקרוסקופ יהיה מוכן.ניתן לצלם את התאים הבקטריאליים שעל הרשת באמצעות מיקרוסקופ אור קריוגני. במקרה זה, ייעשה שימוש במיקרוסקופ Nikon הפוך מותאם אישית, TIB עם בימה קריוגנית משופרת של FEI. טענו את הרשתות לתוך מחסניות בתחנת הקריו והידקו אותן באמצעות טבעות סגירה מנחושת, ולאחר מכן הניחו את המחסנית בתוך מבחנה בחנקן נוזלי לצורך ההעברה.טענו עד שתי מחסניות לבמה הקריוגנית שקוללה מראש והזיזו את הגריד לחלון התצוגה. לאחר מכן, הרדילו את עדשת המעבה ומיקדו את עדשת העצמה על הגריד. אתרו את התאים וצלמו תמונות.לצורך מחקר משולב (correlated) של LM ו-EM. השבכה נסרקת סביב אזור התאים כדי לאתר את התאים מאוחר יותר ב-EM. לאחר הדמיון של השבכה, החזירו את המחסנית לתוך המבחנה ושמרו את המבחנה בחנקן נוזלי עד למועד הדמיון ב-EM, כדי לקבל TOM תלת-ממדי של התא החיידקי.סדרה של תמונות היטל מצולמות בעוד הדגימה מוטה באופן הדרגתי לאורך ציר אחד או שניים ב-cryo TEM. כאן, הפרוצדורה מודגמת באמצעות legon עם cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polar; טענו עד שישה מחסניות לתוך מחזיק רב-בחירה בתחנת הקירור. לאחר מכן, חברו אותו ל-TF 30 Polar, בחרו מחסנית אחת והחדירו אותה לעמוד ה-EM. הפעילו את legend בתוכנת הלקוח במחשב ה-EM.הזינו את תנאי הדמיה עבור המקרא של הסשן. בחרו מטרות בתמונות החל מההגדלה הנמוכה ביותר והעבירו אותן לשלב הבא עם הגדלה גבוהה יותר. לאחר מכן, הניחו את כל המטרות בתור לאסוף סדריות הטיה והגישו את כולן לשלב הטומוגרפיה הסופי.רכשו סדרה של תמונות. הדגימה תוטה באופן הדרגתי לאורך ציר אחד או שניים ב-cryo TEM. לאחר סיום הניסוי, הורד את סדרת ההטיה המלאה לתחנת עבודה מקומית לצורך שחזור.טומוגרמות של התאים הבקטריאליים מחושבות באמצעות תוכנה ייעודית. התוכנה Raptor משמשת לשחזור טומוגרמות באופן אוטומטי, וניתן להשתמש ב-e tomo כדי לבצע זאת באופן חצי-אוטומטי. יש לבחון את סדרת ההטיה באמצעות ה-3D mod viewer של Im MOD ולפסול כל סדרה שאינה צפויה להניב תוצאות בשל שגיאות מעקב או שגיאות אחרות.הרצת tommo raptor מבוצעת בצורה מבוזרת על גבי מכונות הלינוקס במעבדה תוך שימוש בהגדרות הבסיסיות. יצירת הטומוגרף אורכת בין 20 דקות לשעתיים, תלוי בגודל הקובץ. כאשר Raptor נכשל או כאשר חוקר מעוניין לוודא שהשחזור הוא אופטימלי, ניתן להשתמש ב-EMO כדי ליישר את התמונות בקפידה באופן ידני.בצעו את השלבים בכל לשונית בממשק המשתמש (GUI) של e tomo כדי לשחזר את ה-Tom Graham מסדרת ההטיה (Tilt series). אנו משתמשים במסד נתונים פנימי מבוסס רשת כדי לארגן, לאחסן, לחפש ולהפיץ את הנתונים הטומוגרפיים. דף הדפדפן הראשי מציג תמונת ממוזערת וסרטון בדומה לסרטוני YouTube.עבור כל טומוגרמה. לאחר קבלת הטומוגרמות, ניתן לבצע סגמנטציה של מאפיינים בודדים כדי לסייע בהדמיית צורותיהם. סגמנטציה בתלת-ממד היא התהליך של שיוך כל ווקסל (voxel) בתמונת התלת-ממד לאזור או לחומר מסוים.כאן נעשה שימוש בתוכנת שיקוף (mirror software) כדי להפיק מודל שטח שבו כל אזור מוצג בצבע שונה ונצפה בסרטונים ובאנימציות תלת-ממדיות של הטומוגרמה. ניתן ליצור גרפים (Grahams) כדי לסכם פרויקטים ולהמחיש ממצאים בגרפיקה תלת-ממדית. להצגה ויזואלית, ניתן להשתמש בתוכנות כגון Amira או Kymera כדי לרנדר את הפריימים הבודדים של הסרטון והסרטון המסחרי.ניתן להשתמש בתוכנות לעריכת וידאו, כגון Adobe Premier, כדי לערוך את סרטון הפרסומת של התוכנה. לביצוע האנימציה נעשה שימוש ב-Maya. תוכנה זו יכולה לקבל את המשטחים מ-Amira, לבנות פריימים מרכזיים (key frames) ולרנדר אותם לסרטון.כאן מוצגת סדרת הטיה מייצגת של נתוני תא שלם עבור ה-Spiro Treponema Promesa, ולאחריה תצוגה של פרוסות מהטומוגרם השחזור. סגמנטציה של תא ה-T Promesa מבדילה בין ממברנה חיצונית, ממברנה פנימית ומבני שטח, כולל שקעים שטחיי ומסד ש钩 שטחיי. החיידק כולל שוטים ומנוע צמיג, קונו פריפלזמי ופילי.מודל מכני זה מדגים כיצד הספירוכטה treponema Promesa שוחה, כאשר גליל פנימי או ליבה עטוף בנרתיק חיצוני. השוטים נעים כגלילי צבע בין הגליל הפנימי לנרתיק החיצוני. כאשר השוטים מסתובבים, הגליל הפנימי מסתובב בכיוון הפוך בתוך הנרתיק החיצוני.בסביבה שאינה צמיגית, התא מסתובב ללא תועלת, אך בסביבות צמיגיות, כגון אלו שבהן נמצא T. promessa בטבע, סיבים חיצוניים או עצמים אחרים מונעים את הסיבוב של המעטפת החיצונית, ובכך מאיצים את הסיבוב של הגליל הפנימי ומספקים חומרים שהתא יכול להישען עליהם בעודו מקדח את עצמו קדימה. כאן מוצגים תאי T. promessa ממשיים כפי שנצפו באמצעות מיקרוסקופ אור. הרגע הצגנו כיצד לבצע טומוגרפיה קריו-אלקטרונית של תאים בקטריאליים.כמובן, אנו מודעים לכך שסוג זה של עבודה דורש השקעות משמעותיות. מיקרוסקופי הקריו-אלקטרונים ומיקרוסקופי הפלואורסצנציה הם מכשירים מתוחכמים ויקרים, ויש להקימם בצורה נכונה. לדוגמה, היסוד של חדר זה הוא לוח בטון מבודד מכנית, בעובי של מספר רגליים, הנח על קרקע שנדחסה באופן מיוחד.מערכת מיזוג האוויר תוכננה באופן מותאם אישית עם תעלות גדולות וקימורים עדינים כדי לשמור על טמפרטורה קבועה ללא זרמי אוויר או טורבולנציה. הווילונות הנראים בתמונה הוצבו כדי להפחית רעשים אקוסטיים. ולסיום, אנו מוודאים שחדר זה נקי משדות אלקטרומגנטיים מפריעים.בעוד שהפעולות שהראינו לכם במיקרוסקופ הן כיום במידה רבה אוטומטיות, בעיות עדיין עולות לעיתים קרובות ודורשות אבחנה מומחית. עם זאת, אנו מקווים שצפייה בסרטון זה עזרה לכם להבין את הפרוצדורות ואת המכשור המעורבים בסוג זה של עבודה. תודה על תשומת לבכם.

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Chetrit, D., et al. יישום הדמיית תאים חיים וטומוגרפיה קריו-אלקטרונית כדי לפתור מאפיינים מרחביים-זמניים של מערכת ההפרשה Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מתאר כיצד להכין דגימות לגיונלה פנאומופילה לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית על ידי שילוב של תרבית חיידקים, סימון ננו-חלקיקי זהב וטכניקות זיגוג. התהליך משמר מבנים תאיים טבעיים ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של רכיבי מערכת ההפרשה הקשורים לממברנה.

הכנת לגיונלה פנאומופילה לטומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להמחיש דחיסת אן ארעי של כחוליות. טיפוח סינכרונית, פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הקפאה מהירה ו גבוה מתח הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה משמשים. פרוטוקול עבור מתודולוגיות אלה מוצג, יישומים עתידיים ופיתוחים הנדונים.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

מטרת פרוטוקול זה היא לכוון הידבקות תאים וצמיחה לאזורים ממוקדים של רשתות למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. זה מושג על ידי החלת שכבה נגד עכירות כי הוא ablated בדפוסים שצוינו על ידי המשתמש ואחריו תצהיר של חלבוני מטריצה חוץ תאית באזורים בדוגמת לפני זריעת התא.

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

חקור את שיטת ה-tomography קריואלקטרוני לתאים חיידקיים באמצעות טכניקות הקפאה בזריקה והקפאה בלחץ גבוה. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מבנים תוך-תאיים בקרבת מצבם הטבעי.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

גלה סרטונים נוספים