Name: גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: חקור יתירות פונקציונלית בגנים במהלך embryogenesis של דגי זברה Danio rerio באמצעות שילוב morpholinos ודגי דיווח גנטי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנוני פיצוי בין גנים וניתוח תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדה אוונס על עזרתם בהכנת המצגת. Morpholinos השתמשו כאן היו תקפות במקור על ידי ד&quot;ר אודרי Holtzinger. TE נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL064282 ו HL056182). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, של וייל קורנל מדיקל קולג&#39;.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניסוי המתואר כאן, אנחנו בשילוב שני morpholinos, שכל אחד מהם לבדו ליצור מגוון של פנוטיפים שונים, ומצא פנוטיפ שונה לגמרי כשהיו שיתוף מוזרק ביחד. כמובן, אנחנו צריכים להצדיק את ביצוע הניסוי הזה מלכתחילה. חשדנו כי שני גנים יכול לפצות אחד את השני עבור פונקציה קודמת, במפרט במקרה זה הלב. הסיבה לכך היא גנים קשורים מאוד (ומסוגלים מחייב את רצפי DNA זהה) באים לידי ביטוי בדפוסי חופפים במהלך embryogenesis 5. יתר על כן, ניסויים גנטיים תסיסנית ציינו כי גורמי תעתוק gata צריך ל...

<table><tbody><tr><td>מכלי דגירה ומפרידים לדגים</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רשתות לדגים</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי מערכת</td><td></td><td></td><td>60mg Instant Ocean&amp;#8221; לליטר dH2O</td></tr><tr><td>צלוחיות פטרי 100mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למתיחת מחטי מיקרופיפט</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>קפילרות זכוכית 3.5&quot;</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>להב תספורת</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>משחזת מיקרו</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>עינית מיקרוסקופ עם סרגל (Gridded)</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז אולטרה-טהור</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>שפכטל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>מאזניים</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות שקילה חד-פעמיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגל קונבנציונלי</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ארלנמייר</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית למסלידה (סליידים) של מיקרוסקופ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>משורה מדורגת</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה אוטומטית</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת שטיפה אתנול 70%</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>מכל N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק (Microinjector)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>מורפולינו לאתר שחבור של &lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>חוסם ATG של gata5</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>חוסם ATG של איזופורם ארוך של &lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>פיפטת פסטור חד-פעמית</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine Methanesulfonate</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה חדה</td><td>Dumont</td><td></td><td>גודל 55</td></tr><tr><td>זכוכית מיקרוסקופ עם שקע (Depression Microslides)</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

פונקציה ג&#39;ין במהלך embryogenesis מוגדר בדרך כלל על ידי אובדן של פונקציה ניסויים, למשל על ידי mutagenesis ממוקד (נוקאאוט) בתוך העכבר. במודל דג הזברה, יעיל טכניקות גנטיות הפוך פותחו באמצעות microinjection של גן ספציפי morpholinos antisense. Morpholinos יעד mRNA באמצעות זיווג בסיסים ספציפיים גן פונקציה לחסום זמנית על ידי תרגום שחבור עיכוב או במשך מספר ימים במהלך embryogenesis (מציאה). עם זאת, בעלי חוליות כמו עכבר או דג הזברה, פונקציות כמה גנים יכולים להיות מוסתר על ידי גישות אלו בשל נוכחותם של גן אחר אשר מפצה על אובדן. זה נכון במיוחד עבור משפחות גנים המכילים גנים אחותו כי הם שיתוף לידי ביטוי בפיתוח רקמות זהה. בשנת דג הזברה, פיצוי תפקודית ניתן לבדוק באופן יחסית תפוקה גבוהה, על ידי הזרקה משותף של morpholinos כי היעד מציאה של שני גנים בעת ובעונה אחת. כמו כן, באמצעות morpholinos, אינטראקציה גנטית בין כל שני גנים ניתן להדגים על ידי מציאה של גנים שניהם יחד משנה סף רמות. לדוגמה, ניתן morpholinos טיטרציה כזו לא מציאה הפרט יוצר פנוטיפ. אם, בתנאים אלה, שיתוף הזרקה של שני morpholinos גורם פנוטיפ, אינטראקציה גנטית מוצג. כאן אנו מדגימים כיצד להראות יתירות פונקציונלית בהקשר של שני גורמי תעתוק הקשורות גאטה. גורמים gata חיוניים מפרט של אבות לב, אבל זה מתגלה רק על ידי אובדן של שני Gata5 ו Gata6. אנו מראים כיצד לבצע ניסויים microinjection, לאמת את morpholinos, ולהעריך את הפנוטיפ פיצוי cardiogenesis.

פונקציה ג&#39;ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.

תפקוד גנים במהלך האמבריוגנזה מוגדר בדרך כלל באמצעות ניסויי אובדן-תפקוד (loss-of-function), למשל על ידי מוטגנזה מכוונת (knockout) בעכבר. ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע אם שני גנים הם רדונטיים מבחינה תפקודית עבור קביעת שושלת תאים מוגדרת. דבר זה מושג תחילה על ידי הגדרת הפנוטיפ של אובדן התפקוד של כל גן בנפרד, באמצעות הזרקת מורפנוס ספציפיים לגנים לעוברים של דגי זברה בשלבי התפתחות. השלב השני של הפרוצדורה הוא פיתוח בדיקה לכימות של קביעת שושלת התאים או בידולה.לדוגמה, באמצעות שימוש בזן דג רפורטר, כפי שנראה כאן. השלב השלישי של הפרוטוקול הוא שילוב של שני FENO morphs כדי להוביל לאובדן תפקוד של שני הגנים בו-זמנית. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא הערכת הפנוטיפ הנגרם כתוצאה מה-double knockdown.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אובדן או רכישת תפקוד של תאים משושלת ספציפית באמצעות בדיקת הדווח של השושלת (lineage reporter) או ניתוח ביטוי של סמן ספציפי לשושלת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שילוב של נוק-אאוטים (knockouts) במודל עכבר, הוא שניתן לטרגט שניים או אפילו שלושה גנים במודל הדג פשוט על ידי שילוב של מורפוסים (morphos) מתוקפים בניסוי בודד. ניתן להזריק למעלה מ-100 עוברים ולהעריך את הפנוטיפים לאורך מספר ימים.שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח. בביולוגיה התפתחותית, כגון בהגדרת המסלולים השעתוקיים השולטים בגורל התא, מסלולים רגולטוריים מרכזיים מיוצגים לעיתים קרובות על ידי משפחות קטנות של גנים קרובי

a-reverse-genetic-approach-to-test-functional-redundancy-during

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט שמראה נהלים מפורט על איך אנו עורכים את הבדיקה.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

חקור יתירות פונקציונלית בגנים במהלך embryogenesis של דגי זברה Danio rerio באמצעות שילוב morpholinos ודגי דיווח גנטי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנוני פיצוי בין גנים וניתוח תאי גזע.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

גלה סרטונים נוספים