גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע אם שני גנים מיותרים מבחינה תפקודית לצורך אפיון של שושלת תאים מוגדרת. זה מושג על ידי הגדרה ראשונה של פנוטיפ אובדן התפקוד של כל גן בודד באמצעות מורפוס ספציפי לגן שהוזרק לעוברי דג הזברה המתפתחים. השלב השני של ההליך הוא פיתוח בדיקה לכימות מפרט או התמיינות של שושלת תאים.

לדוגמה, שימוש בזן דג מדווח, כפי שנראה כאן. השלב השלישי של ההליך הוא שילוב של שני FENOs מורפים כדי למקד את אובדן התפקוד של שני הגנים בו זמנית. השלב האחרון של ההליך הוא להעריך את הפנוטיפ הנגרם על ידי נוקדאון כפול.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אובדן או עלייה בתפקוד עבור תאים משושלת ספציפית באמצעות בחינת מדווח השושלת או ניתוח ביטוי עבור סמן ספציפי לשושלת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שילוב נוקאאוט במודל העכבר, הוא שניתן למקד שניים או אפילו שלושה גנים במודל הדגים פשוט על ידי שילוב מורפוס מאומת בניסוי יחיד. ניתן להזריק למעלה מ-100 עוברים ולהעריך פנוטיפים במשך מספר ימים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח. בביולוגיה התפתחותית כמו הגדרת מסלולי השעתוק השולטים בגורל התא, מסלולי ויסות מרכזיים מיוצגים לעתים קרובות על ידי משפחות קטנות של גנים קשורים שהם מיותרים מבחינה תפקודית. לכן תפקידם אינו ניכר במחקרי נוקאאוט של עכברים עקב פיצוי מ-Sister Genes.

למרות שמודל זה יכול לספק תובנה לגבי עובריוגנזה של דג הזברה, ניתן ליישם את התוצאות על מערכות אחרות כגון עכבר, מכיוון שאותן תוכניות גנטיות נשמרות בדרך כלל היטב לאורך האבולוציה. הכן צלחות מיקרו-הזרקה לפני הזרקת עוברים. יוצקים כ-12 מיליליטר של 2% אגרוס במי מערכת, שהם מים נקיים שהוצאו ישירות ממערכת מיכל הדגים למכסה ההפוך של צלחת פטרי בגודל 100 מילימטר.

הנח שתי שקופיות מיקרוסקופ בזוויות של כ-45 מעלות לתוך שני צידי המכסה. כאשר האגרוס התמצק, משוך בעדינות את המגלשות הרחק מהמכסה, ויוצר שקתות בהן העוברים ינוחו במהלך ההזרקה, לא נשמרים גבעולים בטמפרטורת החדר בריכוז של מילימולר אחד ומים מזוקקים סטריליים לפני ההזרקה. דגרו על מלאי מורפוס בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להבטיח שהם לגמרי בתמיסה.

מניחים לצירים להתקרר לטמפרטורת החדר. כל מורפו חדש שעוצב חייב להיות מאומת אמפירית לפעילות וסבילות לעובר. בצינורות מיקרו צנטריפוגה, התחל בדילול סדרתי אחד עד שניים של מורפו המלאי במים מזוקקים דה-יונים המניבים ריכוזי עבודה של מילימולר אחד, 0.5 מילימולר, 0.25 מילימולר ו-0.125 מילימולר.

תחת היקף ניתוח, השתמש ביניקה כדי לטעון קדמי מחט הזרקה מכוילת שהוצמדה למיקרו מניפולטור והוצבה כראוי. טען את המחט בכמיקרוליטר אחד של תמיסת המורפו בריכוז הנמוך ביותר. השתמש בפיפטה העברה כדי להעביר עוברי תא אחד מופרים לתוך השקתות של צלחת המיקרו-הזרקה.

השתמש בפיפטה כדי להסיר עודפי מים מהצלחת כך שהעוברים ייפלו לתחתית השוקת. מקם את צלחת ההזרקה מתחת למיקרוסקופ, הורד את המחט דרך הקוריון ואל החלמון. הזרקו כל עובר לפני הוצאת המחט ומיקום מחדש של לוחית ההזרקה כדי לגשת לעובר הבא.

כאשר לומדים להזריק, זה עשוי להיות מועיל להשתמש בצבע חיוני כדי לדמיין את ההזרקה לתא כפי שמוצג כאן, להעביר את העוברים בחזרה לצלחת פטרי של 100 מילימטר עם תרבית מים במערכת ב-28.5 מעלות צלזיוס. הוציאו את כל תמיסת המורפו שנותרה מהמחט, ומלאו אותה במורפו בריכוז הגבוה ביותר הבא להזרקת אצווה הבאה של העוברים בשלב התפתחותי מתאים. בדוק את העוברים עבור פנוטיפים בכל ריכוז מורפו מוזרק.

מינון הסף עבור כל מורפו הוא המינון הנמוך ביותר שבו יש פנוטיפ אמין מוגדר. ייתכן שיהיה צורך במספר סבבים של טיטרציה כדי להגדיר סף לא מדויק. לחפש אינטראקציה גנטית בין שני גנים נפרדים.

הכן תערובת של שני מורפו מעניינים כל אחד בריכוז הסף המתאים לו. חשוב לזכור שהעוברים עשויים שלא לסבול יותר מ-20 ננוגרם של מורפו כולל בכל זריקה. להזריק את העוברים באותו אופן כמו קודם.

שמור על נפחי הזרקה קבועים בין קבוצות הניסוי והביקורת, שאמורות לכלול סטים המוזרקים עם כל מורפו בלבד תחת המיקרוסקופ המנתח. עקוב אחר עוברים מוזרקים מיד לאחר ההזרקה ומספר פעמים במהלך היום, השתמש בפיפטה להעברה כדי להסיר עוברים מתים או גוססים. מכיוון שאלו יכולים לפגוע בכדאיות של המורפינים הנותרים עם העברת פיפטה, עוברים מורדמים או מורדמים בכל עת.

הצביעו על שקופית דיכאון לתצפית. לצילום. השתמש במלקחיים חדים כדי להסיר את הקוריון במידת הצורך.

לייצב את העובר בטיפה של 3% עוברי מסך מתיל צלולוז לפנוטיפ מובהק, ייחודי לשילוב של מורפוס בניגוד לחדירה גדולה יותר של הפנוטיפ של מורפינים בודדים. להלן מספר עוברים מסוג בר כאשר הם מוזרקים עם מורפוס בסף. עבור גאטה חמש, הפנוטיפ האופייני הוא קרדיו ביפידה או שני לבבות, מכיוון שהאבות לא הצליחו להתמזג בקו האמצע.

שימו לב לקרדיומיוציטים החיוביים של GFP המסומנים על ידי החצים. הפנוטיפ של שישה מורפינים כולל לבבות מעוותים שאינם מצליחים ללולאה כראוי. עוברים אלה מפתחים גם קרדיומיוציטים חיוביים ל-GFP.

עם זאת, העוברים שהוזרקו עם שילוב של גאטה חמש וגאטה שש מורפו המוצגים כאן. להציג אובדן מוחלט של התפתחות קרדיומיוציטים המצביע על כך שיש לבטא גאטה חמש או גאטה שש כדי להתפתח קרדיומיוציטים. שני הגנים מיותרים מבחינה תפקודית עבור מפרט קרדיומיוציטים.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב תחילה לאמת באופן מלא את המורפוס שלך ולהיות בטוח ככל האפשר שהם מייצגים נוקדאון אמיתי של יעד גן בודד בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שילוב אללים אפסים מותנים של עכבר על מנת להראות שאותם גנים מתפקדים. כך גם ביונקים.

לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אם שני גנים מיותרים מבחינה תפקודית במהלך האמבריוגנזה.