הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחדיר אוליגונוקלאוטידים מסוג morpholino באמצעות הזרקות לחדר הנקיב בזחלים, ולבצע השתקה של גנים כדי להעריך את תפקודם במהלך ההתחדשות. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמת הזחלים והנחתם בתוך חריץ של תבנית הקיבוע. לאחר מכן, מחט ההזרקה מוחדרת לחדר הלב.

לאחר מכן, מזריקים את תמיסת ה-morpho ארבע עד שש פעמים לתוך החדריות, עם מרווחי המתנה בין הפולסים כדי לאפשר את פינוי הלב. לבסוף, קוטעת את סנפיר הזנב ומניחים לו להתחדש במשך שלושה ימים. לבסוף, ניתן להעריך את ההשפעה על התחדשות הסנפיר על ידי מדידת השטח שהתחדש בסנפיר באמצעות כלי מעקב הקווים (line tracing tool) של תוכבת הקוד הפתוח Fiji image J.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון טרנסגנזה או מוטגנזה, הוא שהיא מאפשרת השתקה (knockdown) של גנים באמצעות morphinos ברקמות של זחליים שאינן מתאימות להזרקות ישירות. באמצעות קפילריות זכוכית בעלות קוטר של 0.75 millimeter, מקם אחת בתוך מושך מחטים ומשוך את המחט עם הפרמטרים הבאים; בעזרת פינצטה של שעון, ותחת סטריאוסקופ עם עינית מיקרומטר, שבור את הקפילריה שנמשכה כדי ליצור מחט בקוטר של 20 micrometer. לאחר מכן, השתמש במחרטה עם גלגל סיבוב גומי מותאם כדי להשחיז את המחט וליצור שיפוע (bevel) של 20 micrometer. הכן את מלאי ה-morpho על ידי המסה של Morpho ליפיליזציה ב-one XPBS עד לריכוז סופי של 7.5 millimolar.

הכינו את תמיסת ההזרקה של ה-Morpho על ידי ערבוב של 2.5 µL של תמיסת Morpho מלאי עם 2.8 µL של תמיסת endo Porter מלאי בריכוז 1 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 3.5 mM morph ו-0.5 mM endo porter לצורך ביצוע ההזרקות. השתמשו במיקרו-פיפט עם טיפ של 10 µL כדי לטעון את מחט הזכוכית המשופעת עם 5 µL של תמיסת morpho. לאחר מכן, הכניסו את מחט הזכוכית למחזיק המחטים של המיקרו-מניפולטור המחובר לפומפה פניאומטית (pneumatic pico pump).

כוון את זווית ההזרקות לכ-45 מעלות, כך שהמחט תצטרך לנוע רק במישור אחד. לאחר מכן, הגדר את ערכי המיקרו-מזרק (micro injector) באופן הבא: לחץ החזקה (hold pressure) של 20 pounds per square inch או PSI, לחץ פליטה (ejection pressure) של 15 PSIA, טווח שער (gating range) של 100 millisecond וערך תקופה (period value) של 1.9, המתאים ל-10.9 milliseconds. הכן 20 milliliters של 1.5% agarose מומס ב-1XPBS ושפוך אותו לתוך צלחת פטרי של 10 centimeter.

לאחר מכן, מקמו תבנית הזרקה בעלת חריצים בתוך האגאר החם כדי ליצור תלמים בג'ל שהתגבש להרדמת הזחלים. העבירו אותם ל-100 milliliters של מי אקווריום עם 20 milligrams לליטר של trican. לאחר שהם מפסיקים להגיב למגע, השתמשו בפיפטת פלסטיק פסטורל כדי להעביר בזהירות את הזחל לחריץ בתבנית האגאר הרטובה, כך שהצד הבטני פונה לדופן האנכית של חריץ האגאר.

הניחו את פלטת ה-aros תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי כך שהחדר פונה הרחק ממחט ההזרקה. לאחר מכן, הורידו את המחט והחדירו אותה כ-1 עד 2 µm לתוך חדר הלב. יש להיזהר לא להחדיר אותה עמוק מדי.

לאחר מכן, הזרק פעימה של 3 nL של תמיסת Morpho לתוך החדר (ventricle) והמתן לניקוי הלב לפני חזרה על הפעולה עם חמש פעימות נוספות לאחר ההזרקה; הוצא את המחט והנח אותה בתוך צלח פטרי המכיל 1X PBS כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, באמצעות פ pipette העברה מלאה במצע E3, העבר בזהירות את הזחלים בחזרה לצלח פטרי המכיל מצע E3 טרי כדי להבטיח ספיגה ושמירה של ה-morpho בתאים. חזור על ההזרקות כל 12 עד 24 שעות למשך משך הניסוי כדי להעריך את ההזרקות.

לאחר הרדמת הדגים, הניח אותם על פלטת אגרוס (aros) רטובה ושטוחה המכוסה במצע E three, לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאומשקוף עם שדה בהיר ופלואורסצנציה לצילומם. נתח את התמונות לבחינת הרגנרציה באמצעות תוכנת Fiji Image J החינמית, תוך שימוש בכלי מעקב הקו (line tracing tool) כדי לקבוע את כמות הצמיחה הרגנרטיבית שהתרחשה. ראשית, בצע כיול של התמונות על ידי גרירה והשלכה של קובץ לחלון ה-Fiji הראשי בתפריט הראשי.

הגדירו את קנה המידה עבור כל התמונות על ידי לחיצה על analyze בתפריט הנפתח. לחצו על set scale, ולאחר מכן הפעילו את האפשרות הגלובלית על ידי סימון תיבת הסימון. כעת גררו ושחררו את התמונה שוב כדי למדוד את כמות הצמיחה הרגנרטיבית בסרגל הכלים.

בחרו בכלי הברירה החופשית (freehand selections tool) והקיפו את האזור למדידה. לבסוף, לחצו על Ctrl M. פעולה זו תפתח חלון תוצאות חדש המציג את ערך השטח של האזור המוקף בפיקסלים רבועים. כפי שניתן לראות כאן דקות ספורות לאחר ההזרקה, תמיסת morpho endo porter מתפזרת ברחבי מערכת כלי הדם לרקמות שונות, כגון קפלי הסנפיר והמוח, למשך 12 שעות או יותר.

כדי להעריך את ההתחדשות של מבני סנפיר זחליים דיסטליים, הוסרו המבנים הבאים: הקצה הדיסטלי של קיפולי הסנפיר והחוט השדרה, החוט השדרה הדיסטלי, שריר הגו הדיסטלי (שאינו נראה כאן), ותאי פיגמנט, שקשה לטרגט באמצעות הזרקה ישירה, אך נראה שהם קולטים את ה-morpho לאחר הזרקות ונטריקולריות סדרתיות. לפיכך, שיטה זו מקלה יחסית על העברת ה-morpho לרקמות שקשה לטרגט באופן אינדיבידואלי, והיא מאפשרת להעריך את תפקוד הגנים במספר רקמות בסנפיר המתחדש בו-זמנית. כדי לנתח את חשיבותם של גנים ספציפיים המעורבים בהתחדשות, סנפיר הזחל נקטע חלקית, וכל הרקמות שקלטו את ה-morpho מוסרות.

קיפול סנפיר הזחל משחזר את מבנהו תוך מספר ימים לאחר קטיעה, כפי שהודגם. כאן, morpho המכוון לגנים הדרושים לרגנרציה, שיבש את תגובת ההתחדשות בהשוואה לבקרות שלא הוזרקו ובקרות mismatch morpho לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרגנרציה לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהתחדשות סנפיר דג הזברה.