הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר אוליגונוקלאוטידים של morph eno באמצעות הזרקות חדריות לתוך הזחל, סנפיר הקיפוד ולהפיל גנים כדי להעריך את תפקודם במהלך ההתחדשות. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה של הזחל והנחתו בחריץ של תבנית הארוס. לאחר מכן, מחט ההזרקה מוחדרת לחדר הלב.

לאחר מכן תמיסת המורפו מוזרקת ארבע עד שש פעמים לחדר עם מרווחי שקלול בין פולסים כדי לאפשר פינוי של הלב. לבסוף, סנפיר הפינוק נקטע ומאפשר לו להתחדש במשך שלושה ימים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההשפעה על התחדשות הסנפיר על ידי מדידת השטח המחודש של הסנפיר באמצעות כלי מעקב הקווים של תוכנת הקוד הפתוח Fiji image J.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנסגנזה או מוטגנזה, הוא בכך שהיא מאפשרת להפיל גנים על ידי מינוס ברקמות זחל שאינן מתאימות להזרקה ישירה באמצעות נימי זכוכית בקוטר 0.75 מילימטר, הניחו אחד לתוך מושך מחט ומשכו את המחט עם הפרמטרים הבאים בעזרת פינצטה של יצרני שעונים, ותחת סטריאוסקופ עם עינית מיקרומטר, שוברים את הנימים הנמשכים כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר. לאחר מכן השתמש במחרטה עם גלגל מסתובב מגומי נשוי כדי לחדד את המחט ולייצר שיפוע של 20 מיקרומטר. הכן את מלאי המורפו על ידי המסת המורפו הליופילי ב-XPBS אחד לריכוז סופי של 7.5 מילי-מולר.

מערבבים את תמיסת הזרקת Morpho על ידי שילוב של 2.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Morpho עם 2.8 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אנדו פורטר מילי-מולרית אחת לריכוז סופי של 3.5 מילי-מולרי ו-0.5 מילי-מולרי אנדו פורטר לביצוע זריקות. השתמש במיקרו פיפטה עם קצה של 10 מיקרוליטר כדי להעמיס את מחט הזכוכית המשופעת בחמישה מיקרוליטר של תמיסת מורפו. לאחר מכן הכנס את מחט הזכוכית למחזיק המחט של המניפולטור המיקרו המחובר למשאבת הפיקו הפנאומטית.

כוונן את זווית ההזרקות לכ-45 מעלות כך שיהיה צורך להזיז את המחט רק בכיוון פלנר אחד. לאחר מכן, הגדר את ערכי מזרק המיקרו באופן הבא, לחץ אחיזה של 20 פאונד לאינץ' מרובע או PSI לחץ פליטה של 15 PSIA טווח של 100 אלפיות השנייה של שער וערך תקופה של 1.9, המתאים ל-10.9 אלפיות השנייה. מכינים 20 מיליליטר 1.5% מומס ב- XPBS אחד ויוצקים אותו לצלחת פטרי של 10 סנטימטרים.

לאחר מכן הניחו תבנית הזרקה מחורצת לתוך הארוס החם כדי ליצור תלמים בג'ל המוקשה כדי להרדים זחלים. מניחים אותם ב-100 מיליליטר מי אקווריום עם 20 מיליגרם לליטר טריקן. לאחר שהם מפסיקים להגיב למגע, השתמשו בפיפטה פסטורלית מפלסטיק כדי להעביר את הזחל בזהירות לתוך חריץ של תבנית הארוס הרטובה כך שצד הגחון פונה לדופן הארוס האנכית של החריץ.

הנח את צלחת הארוס מתחת למיקרוסקופ הסטריאו כך שהחדר פונה הרחק ממחט ההזרקה. לאחר מכן, הורידו את המחט והכניסו אותה כמיקרומטר עד שניים לחדר הלב. הקפד לא להכניס אותו עמוק מדי.

לאחר מכן יש להזריק פולס של שלושה ננו-ליטר של תמיסת מורפו לתוך החדר והמשקל כדי לאפשר פינוי של הלב לפני החזרה עם חמישה פולסים נוספים לאחר ההזרקה, הסר את המחט והנח אותה בצלחת פטרי המכילה XPBS אחד כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, באמצעות פיפטה ממולאת ב-E שלוש מדיום, העבירו בזהירות את הזחלים בחזרה לצלחת פטרי המכילה E טרי, שלושה בינוניים כדי להבטיח קליטה ותחזוקה של המורפו בתאים. חזור על הזריקות כל 12 עד 24 שעות למשך הניסוי כדי להעריך את הזריקות.

לאחר הרדמת הדגים, הניחו אותם על צלחת ארוס שטוחה ורטובה מכוסה ב-E שלושה מדיום לפני שימוש במיקרוסקופ סטריאו עם שדה בהיר ופלואורסצנטי כדי לצלם אותם. נתח תמונות להתחדשות באמצעות התוכנה החינמית Fiji Image J כדי להשתמש בכלי מעקב הקווים כדי לקבוע את כמות הצמיחה המתחדשת שהתרחשה. ראשית, כייל את התמונות על ידי גרירה ושחרור של קובץ לחלון הראשי של פיג'י בתפריט הראשי.

הגדר את קנה המידה עבור כל התמונות על ידי לחיצה על נתח בתפריט הנפתח. לחץ/י על ״הגדר קנה מידה״ והפעל/י את האפשרות הכללית על-ידי לחיצה על תיבת הסימון. כעת גרור ושחרר את התמונה שוב כדי למדוד את כמות הצמיחה המתחדשת בסרגל הכלים.

בחרו בכלי הבחירה ביד חופשית והקיפו את האזור למדידה. לבסוף, לחץ על Ctrl M.פעולה זו תפתח חלון תוצאות חדש המציג את הערך של האזור המוקף בפיקסלים מרובעים. כפי שניתן לראות כאן תוך דקות מההזרקה, תמיסת המורפו אנדו פורטר מתפשטת בכל כלי הדם לרקמות שונות כגון קפל הסנפיר והמוח למשך 12 שעות או יותר לפחות.

כדי להעריך את ההתחדשות של מבני סנפיר הזחל הדיסטלי, הוסרו הדברים הבאים: הקצה הדיסטלי של קפל הסנפיר וחוט השדרה, החוט, שריר תא המטען הדיסטלי, שאינו נראה כאן, ותאי פיגמנט, שקשה לכוון אליהם בהזרקה ישירה, אך נראה שהם משלבים את המורפו לאחר הזרקות חדריות סדרתיות. לפיכך, שיטה זו מקדמת בקלות יחסית העברת מורפו לרקמות שקשה לכוון אליהן בנפרד, והיא מאפשרת הערכה של תפקוד הגנים במספר רקמות בסנפיר המתחדש בו זמנית. כדי לנתח את חשיבותם של גנים ספציפיים המעורבים בהתחדשות, סנפיר הזחל נכרת חלקית, וכל הרקמות ששילבו את המורפו נכרתות.

קפל סנפיר הזחל מחדש את מבנהו תוך מספר ימים לאחר הקטיעה כפי שהודגם. כאן, מורפו מכוון לגנים הנדרשים להתחדשות, הפריע לתגובת ההתחדשות בהשוואה לבקרות מורפו שהוזרקו וחוסר התאמה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההתחדשות לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהתחדשות של סנפיר דג הזברה.