Name: הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למד שיטת הפוך גנטית בזחלי דג הזברה באמצעות הזרקת מורפולינו לחדר הלב. שיטה זו מאפשרת לחקור תפקוד גנים ברקמות קשות ליעד בתהליכי התחדשות רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי (DFG), ברצוננו להודות Ayele Tsedeke Taddese לקבלת תמיכה טכנית.

1. הכנת מחטי הזכוכית (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנימי זכוכית בקוטר 0.75 מ&quot;מ להכין מחטי הזרקה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את נימי הזכוכית לתוך חולץ מחט ולמשוך את המחט עם הפרמטר הבא: ערך מחזור חימום: 463; משיכת ערך מחזור: 230; מהירות: 150 אלפיות השניים; זמן: 150 אלפיות שני (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את זכוכית משך נימים עם פינצטה שען כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר תחת stereoscope עם עינית מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחרטה עם גלגל מסתובב גומי רטוב כדי לחדד את המחט ולייצר 20 מיקרומטר הטיה (1C דמויות ו1D). הערה: שארפ, מחטים משופעות לשפר את הקלות של כניסה לתוך החדר ובכך למזער את הנזק לרקמות ולאפשר לשרירים המחוררים כדי לחתום מחדש לאחר הסרת המחט (איורים 1E-G). </li></ol> 2. Preparע פתרון morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית morpholino ידי המסת morpholino lyophilized ב1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) לריכוז סופי של 7.5 מ&quot;מ. [ראה את הוראות יצרן לפרטים (טבלת חומרים)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הזרקת morpholino על ידי ערבוב של פתרון מניות morpholino 2.5 μl (7.5 מ&quot;מ) עם פתרון 2.8 μl Endo-פורטר המניה (1 מ&quot;מ) (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 3.5 morpholino מ&quot;מ ו0.5 מ&quot;מ Endo-פורטר. </li></ol> 3. הכנת הזרקת morpholino (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחט זכוכית המשופעת עם 5 μl של פתרון זה באמצעות micropipette עם קצה פיפטה microloader 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט של micromanipulator מחובר למשאבת פיק פנאומטי (איורים 2A-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את בעל המחט ליד מיקרוסקופ כך מחט הצרכים רקכדי להתרגש בכיוון מישוריים אחד להכניס אותו לתוך חדר הלב של הזחל (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הזווית לזריקות ב-45 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערכי microinjector כדלקמן: לחץ אחיזה: 20 פאונד לאינץ&#39; המרובע (psi); לחץ פליטה: 15 psi; 100 מגוון אלפיות של gating, ערך תקופה של 1.9 (מתאים ל10.9 אלפית שני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose ב 1x PBS באמצעות מיקרוגל סטנדרטי לייצר 20 מיליליטר של 1.5% (w / v) ג&#39;ל. יוצקים ג&#39;ל נמס לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר. הנח צורת הזרקת מחורץ לagarose החם, כך שפעם אחת קשוח, agarose יהיה תלמים שבזחל המסוממים יוצב 11 (2D דמויות ו2E). </li></ol> 4. זריקות (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זחל במי אקווריום 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ&quot;ג / ליטר (sulfonate L-אתיל-M-אמינו-נזואט מתאן), עד שהם יפסיקו להגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipett פסטר מפלסטיקדואר להעביר בזהירות את הזחל מסומם לתוך חריץ של עובש agarose הרטוב, כך שהצד הגחוני פונה אל קיר agarose האנכי של הגרוב (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת agarose תחת סטראו כך שהחדר הוא מול מן מחט הזריקה (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט להכניס אותו לתוך חדר הלב. הכנס את המחט רק 1-2 מיקרומטר לתוך החדר נזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי (3B דמויות ו3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמחט מוחדרת, להזריק את פתרון morpholino לתוך החדר עם 4-6 קטניות, כל 3 NL אספקת של הפתרון, עם מחכה מרווחים כדי לאפשר סליקה של הלב (3D דמויות ו3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להוציא את המחט (במקביל למישור של הכנסה) ולאחר מכן להעביר בזהירות את הזחל בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מלא בbac הבינוני E3k לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני E3 טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט לתוך צלחת פטרי המכילה 1x PBS כדי למנוע הייבוש של המחט בעת העברת הזחל המוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.1-4.6 כל שעה 12-24 לתקופת הניסוי. הערה: חזרה על הזריקות מבטיחה הספיגה ותחזוקה של morpholino בתאים. </li></ol> 5. ניתוח של זריקות (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדגים באקווריום של מים 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ&quot;ג / ליטר עד שהם יפסיקו להגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל רוחבי על 1.5% רטובים שטוחים (w / v) agarose צלחת מכוסה במדיום E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי תמונה באמצעות סטראו עם brightfield ודימות פלואורסצנטי. הערה: כפי שהזחלים הם שקופים, morpholino מתויג והעמסת צריך להיות גלוי כמו ירוק ניאון בכלי דם בכל בעלי החיים באופן ישיר לאחר הזרקה. הקרינה זו תתפזר יותר לתוך רקמות vascularized ידי15 דקות (איורים 4 א-4C). </li></ol> 6. הערכת הרגנרציה תולדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך תמונות שנתפסו באמצעות תוכנת פיג&#39;י תמונת J בחינם (http://fiji.sc/Fiji). לחקירת התחדשות, השתמש בכלי מעקב אונליין כדי לקבוע את הכמות של צמיחת התחדשות שחלה על שליטה וזחל הזריק morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל תמונות, פתח את אחד קבצי תמונה המקוריים בפיג&#39;י על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון פיג&#39;י הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את קנה המידה לכל התמונות הבאות, ללכת על &quot;נתח&quot; בתפריט הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפתח לחץ על תפריט &quot;סולם הגדר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון זה, להפעיל את האפשרות &quot;הגלובלית&quot; על ידי לחיצה על תיבת הסימון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לפתוח את התמונה כדי למדוד את הכמות של צמיחת משובי שוב על ידי גרירה ושחרור (ראה שלב 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;בחירות חופשי&quot; בסרגל הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקיף את האזור כדי להימדד (Figures 4J-4L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על Ctrl + M. הפעולה זו תפתח חלון חדש &quot;תוצאות&quot; המציג את ערכו של השטח מוקף בפיקסלים מרובעים. </li></ol>

<ol><li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li>
<li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics%3A+moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li>
<li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li>
<li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li>
<li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmour%2C+DT+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+morpholino+experiments%3A+don%27t+stop+making+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li>
<li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li>
<li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Re.+Pathol.+Mech.+Dis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li>
<li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li>
<li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li>
<li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legless%2C+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li>
<li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן חשיפה מינימאלית בפתרון הרגעה. מחטים כי הם קטנים מדי תסתומנה לעתים קרובות, בעוד מחטים כי הם גדולים מדי יפגעו בחדר ולגרום לדימום יתר. בעוד 20 מיקרומטר מומלץ, המחט אף פעם לא צריכה להיות יותר מחמישית בגודל של החדר ש...

התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים. דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות 1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה 2, 3. עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה. גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה 4, 5. לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא. </p&gt; Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות 6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated. על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי 9 של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר 10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.

<table><tbody><tr><td>מורפולינו עם 3&אקוטי; תג פלואורסצאין</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>מותאם אישית</td><td>מידע נוסף בכתובת www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>מידע נוסף ב-www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>למזיגת צלחות להנחת הדגים במהלך הזרקות והדמיה</td></tr><tr><td>טריקאין (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)</td> <td>Applichem</td><td></td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>מדיום E3 (5 מ"מ NaCl; 0.17 מ"מ KCl; 0.33 מ"מ CaCl<תת>2; 0.33 מ"מ MgSO4)</td><td></td><td></td> <td>לגידול זחלים</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>להצבת הדגים במהלך הזרקות והדמיה</td></tr><tr><td>נימי זכוכית דקים של</td> קיר World <td>Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>להכנת מחטי הזרקה</td></tr><tr><td>קצות פיפטות מיקרו-מעמיס</td><td>אפנדורף</td><td>5,242,956,003</td><td>להעמסת המחט</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר (3 מ"ל/1 מ"ל)</td><td>מותג</td><td>747760/74775</td><td>להעברת</td></tr><tr><td>זחל חולץ מחט בוער/חום</td><td>סאטר</td><td></td><td>מידע נוסף ב-www.sutter.com</td></tr><tr><td>שען (דומונט) פינצטה (מידה 5)</td><td>דיוק עולמי אינסטרומנטס בע"מ</td><td>501985</td><td>כדי לבלום את המחט לפני השחזה</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס, לייקה, זייס</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>חלק מכל מערך ההזרקה</td></tr><tr><td>מצלמת פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס, לייקה, זייס</td><td>משתנה עם היצרן</td><td>כדי לדמות את הקרינה לאחר ההתקנה</td></tr><tr><td>ערכת PicoNozzle (מחזיק מיקרו-מזרק)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>עבור מיקרו-הזרקות</td></tr><tr><td>פנאומטיות PicoPump (מיקרו-מזרק)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>למיקרו-הזרקות</td></tr></tbody></table>

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.

המחט החדה, משופעת ההזרקה ממוקמת בקלות בחדר הלב של זחל דג הזברה כאשר ניגש dorsally (איור 3 א). הלב ממשיך לשאוב ונשמרת זרימת דם למרות נוכחותם של המחט (3B דמויות ו3 ג). זריקות להיזהר לא לשבש את המורפולוגיה של החדר או התכווצויות לב (איור 3D) למרות הזרקה של morpholino ללב (איור 3E). בתוך דקות, פתרון morpholino-Endo-פורטר מפיץ בכל הגוף באמצעות כלי הדם ...

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחדיר אוליגונוקלאוטידים מסוג morpholino באמצעות הזרקות לחדר הנקיב בזחלים, ולבצע השתקה של גנים כדי להעריך את תפקודם במהלך ההתחדשות. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמת הזחלים והנחתם בתוך חריץ של תבנית הקיבוע. לאחר מכן, מחט ההזרקה מוחדרת לחדר הלב.לאחר מכן, מזריקים את תמיסת ה-morpho ארבע עד שש פעמים לתוך החדריות, עם מרווחי המתנה בין הפולסים כדי לאפשר את פינוי הלב. לבסוף, קוטעת את סנפיר הזנב ומניחים לו להתחדש במשך שלושה ימים. לבסוף, ניתן להעריך את ההשפעה על התחדשות הסנפיר על ידי מדידת השטח שהתחדש בסנפיר באמצעות כלי מעקב הקווים (line tracing tool) של תוכבת הקוד הפתוח Fiji image J.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון טרנסגנזה או מוטגנזה, הוא שהיא מאפשרת השתקה (knockdown) של גנים באמצעות morphinos ברקמות של זחליים שאינן מתאימות להזרקות ישירות. באמצעות קפילריות זכוכית בעלות קוטר של 0.75 millimeter, מקם אחת בתוך מושך מחטים ומשוך את המחט עם הפרמטרים הבאים; בעזרת פינצטה של שעון, ותחת סטריאוסקופ עם עינית מיקרומטר, שבור את הקפילריה שנמשכה כדי ליצור מחט בקוטר של 20 micrometer. לאחר מכן, השתמש במחרטה עם גלגל סיבוב גומי מותאם כדי להשחיז את המחט וליצור שיפוע (bevel) של 20 micrometer. הכן את מלאי ה-morpho על ידי המסה של Morpho ליפיליזציה ב-one XPBS עד לריכוז סופי של 7.5 millimolar.הכינו את תמיסת ההזרקה של ה-Morpho על ידי ערבוב של 2.5 µL של תמיסת Morpho מלאי עם 2.8 µL של תמיסת endo Porter מלאי בריכוז 1 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 3.5 mM morph ו-0.5 mM endo porter לצורך ביצוע ההזרקות. השתמשו במיקרו-פיפט עם טיפ של 10 µL כדי לטעון את מחט הזכוכית המשופעת עם 5 µL של תמיסת morpho. לאחר מכן, הכניסו את מחט הזכוכית למחזיק המחטים של המיקרו-מניפולטור המחובר לפומפה פניאומטית (pneumatic pico pump).כוון את זווית ההזרקות לכ-45 מעלות, כך שהמחט תצטרך לנוע רק במישור אחד. לאחר מכן, הגדר את ערכי המיקרו-מזרק (micro injector) באופן הבא: לחץ החזקה (hold pressure) של 20 pounds per square inch או PSI, לחץ פליטה (ejection pressure) של 15 PSIA, טווח שער (gating range) של 100 millisecond וערך תקופה (period value) של 1.9, המתאים ל-10.9 milliseconds. הכן 20 milliliters של 1.5% agarose מומס ב-1XPBS ושפוך אותו לתוך צלחת פטרי של 10 centimeter.לאחר מכן, מקמו תבנית הזרקה בעלת חריצים בתוך האגאר החם כדי ליצור תלמים בג'ל שהתגבש להרדמת הזחלים. העבירו אותם ל-100 milliliters של מי אקווריום עם 20 milligrams לליטר של trican. לאחר שהם מפסיקים להגיב למגע, השתמשו בפיפטת פלסטיק פסטורל כדי להעביר בזהירות את הזחל לחריץ בתבנית האגאר הרטובה, כך שהצד הבטני פונה לדופן האנכית של חריץ האגאר.הניחו את פלטת ה-aros תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי כך שהחדר פונה הרחק ממחט ההזרקה. לאחר מכן, הורידו את המחט והחדירו אותה כ-1 עד 2 µm לתוך חדר הלב. יש להיזהר לא להחדיר אותה עמוק מדי.לאחר מכן, הזרק פעימה של 3 nL של תמיסת Morpho לתוך החדר (ventricle) והמתן לניקוי הלב לפני חזרה על הפעולה עם חמש פעימות נוספות לאחר ההזרקה; הוצא את המחט והנח אותה בתוך צלח פטרי המכיל 1X PBS כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, באמצעות פ pipette העברה מלאה במצע E3, העבר בזהירות את הזחלים בחזרה לצלח פטרי המכיל מצע E3 טרי כדי להבטיח ספיגה ושמירה של ה-morpho בתאים. חזור על ההזרקות כל 12 עד 24 שעות למשך משך הניסוי כדי להעריך את ההזרקות.לאחר הרדמת הדגים, הניח אותם על פלטת אגרוס (aros) רטובה ושטוחה המכוסה במצע E three, לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאומשקוף עם שדה בהיר ופלואורסצנציה לצילומם. נתח את התמונות לבחינת הרגנרציה באמצעות תוכנת Fiji Image J החינמית, תוך שימוש בכלי מעקב הקו (line tracing tool) כדי לקבוע את כמות הצמיחה הרגנרטיבית שהתרחשה. ראשית, בצע כיול של התמונות על ידי גרירה והשלכה של קובץ לחלון ה-Fiji הראשי בתפריט הראשי.הגדירו את קנה המידה עבור כל התמונות על ידי לחיצה על analyze בתפריט הנפתח. לחצו על set scale, ולאחר מכן הפעילו את האפשרות הגלובלית על ידי סימון תיבת הסימון. כעת גררו ושחררו את התמונה שוב כדי למדוד את כמות הצמיחה הרגנרטיבית בסרגל הכלים.בחרו בכלי הברירה החופשית (freehand selections tool) והקיפו את האזור למדידה. לבסוף, לחצו על Ctrl M. פעולה זו תפתח חלון תוצאות חדש המציג את ערך השטח של האזור המוקף בפיקסלים רבועים. כפי שניתן לראות כאן דקות ספורות לאחר ההזרקה, תמיסת morpho endo porter מתפזרת ברחבי מערכת כלי הדם לרקמות שונות, כגון קפלי הסנפיר והמוח, למשך 12 שעות או יותר.כדי להעריך את ההתחדשות של מבני סנפיר זחליים דיסטליים, הוסרו המבנים הבאים: הקצה הדיסטלי של קיפולי הסנפיר והחוט השדרה, החוט השדרה הדיסטלי, שריר הגו הדיסטלי (שאינו נראה כאן), ותאי פיגמנט, שקשה לטרגט באמצעות הזרקה ישירה, אך נראה שהם קולטים את ה-morpho לאחר הזרקות ונטריקולריות סדרתיות. לפיכך, שיטה זו מקלה יחסית על העברת ה-morpho לרקמות שקשה לטרגט באופן אינדיבידואלי, והיא מאפשרת להעריך את תפקוד הגנים במספר רקמות בסנפיר המתחדש בו-זמנית. כדי לנתח את חשיבותם של גנים ספציפיים המעורבים בהתחדשות, סנפיר הזחל נקטע חלקית, וכל הרקמות שקלטו את ה-morpho מוסרות.קיפול סנפיר הזחל משחזר את מבנהו תוך מספר ימים לאחר קטיעה, כפי שהודגם. כאן, morpho המכוון לגנים הדרושים לרגנרציה, שיבש את תגובת ההתחדשות בהשוואה לבקרות שלא הוזרקו ובקרות mismatch morpho לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרגנרציה לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהתחדשות סנפיר דג הזברה.

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

פונקציה ג'ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

הפרוטוקול מתאר הפלה ממוקדת של ביטוי גנים בדגי זברה על ידי הזרקת מורפולינו בזנב.

הזרקת מורפולינו: שיטה להפיל ביטוי גנים במטרה לחקור תפקוד בדגי זברה

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.

החדר דג הזברה המוח Injection

כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

למד שיטת הפוך גנטית בזחלי דג הזברה באמצעות הזרקת מורפולינו לחדר הלב. שיטה זו מאפשרת לחקור תפקוד גנים ברקמות קשות ליעד בתהליכי התחדשות רקמות.

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

גלה סרטונים נוספים