הדמיית ביטוי חלבון מבוססת קובייה: הליך להדמיית ביטוי חלבון בעובי מלא ביופסיות עור עכבר

- העור הוא איבר מורכב המורכב מאוכלוסיות תאים מגוונות המסודרות במספר שכבות. CUBIC, טכניקת הדמיה תלת-ממדית מבוססת ניקוי רקמות, מסייעת לדמיין דפוסי ביטוי חלבונים בתוך תאי עור אלה באמצעות ביופסיות עור שלמות. התחילו בלקיחת עכבר שעבר המתת חסד והסרת שיער מאזור הצוואר הגבי שלו. הבלו חתיכת עור לחתוך אותו לחתיכות קטנות.

השקיעו את החתיכות בתמיסת סליקה CUBIC1 ודגרו. תאי העור אינם שקופים, בשל נוכחותם של כרומופורים ושומנים הגורמים לפיזור אור. הכימיקלים בתמיסה המעוקבת מסירים מולקולות אלה, ובכך מפחיתים את פיזור האור והופכים את הרקמה לשקופה.

לאחר מכן, טפלו ברקמה באמצעות הנוגדנים הראשוניים הרצויים הנקשרים באופן ספציפי לחלבוני המטרה התוך-תאיים המתבטאים בתאי העור. יתר על כן, לטפל עם נוגדנים משניים מסומנים פלואורסצנטית להיקשר קומפלקסים נוגדנים ראשוניים חלבון. מכתימים את הרקמה בצבע קושר DNA שמכתים את הגרעין.

לבסוף, לטבול את הדגימה בתמיסת CUBIC2. התמיסה מפחיתה עוד יותר את פיזור האור בתוך הרקמה, מה שהופך אותה לשקופה יותר להדמיה. התבונן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמיין אזורים בעלי תווית פלואורסצנטית של עניין בדגימה התלת-ממדית. הפרוטוקול הבא מאפשר הדמיה של ביטוי סמני התפשטות קרטינוציטים בביופסיות עור שלמות באמצעות פרוטוקול CUBIC.

- התחילו בשימוש בגוזמים כדי לגלח את השיער מצווארו של עכבר שעבר המתת חסד, תוך הקפדה שלא לפצוע את העור. לאחר מכן, לטהר את העור עם אתנול 70% PBS. לאחר מכן, הרימו את עור הצוואר הגבי בעזרת מלקחיים והשתמשו במספריים כדי להסיר שטח של כ-1.5 על 4 סנטימטרים מעור העכבר הגבי. לאחר מכן, שטח את העור, צד הדרמיס כלפי מטה, על פיסת נייר פילטר, תוך ציון הכיוון הקדמי-אחורי של הדגימה וחתוך את הנייר סביב העור המנותח.

- להדמיה אופטימלית, דגימות העור צריכות להישאר שטוחות עם כיוון זקיק שיער עקבי. כדי לשמור על הדגימות בתנוחה אנטרו-אחורית נכונה, אנו מקבעים את פיסות העור על נייר סינון בביופסיות מלבניות.

- העבירו את הדגימות לצינור 15 מיליליטר מלא ב-4% PFA טרי ב-PBS. לאחר מכן, לאחר שהם מקובעים היטב לנייר הסינון, העבירו את הדגימות לשפופרת חדשה של 15 מיליליטר של PBS לשתי שטיפות של 5 דקות.

כדי לנקות את ביופסיות העור לאחר השטיפה השנייה, השתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך את הרקמות לחתיכות של כ 0.2 על 0.5 סנטימטר, תוך דאגה כי הצדדים הארוכים יותר של הדגימות נחתכים לאורך הכיוון הקדמי-אחורי של הדגימות.

- חיתוך הצד הארוך יותר של הביופסיה במקביל לכיוון זקיקי השערה מסייע גם הוא במניעת נזק נרחב לזקיקי השיער.

- לאחר מכן, השקיעו את הביופסיות ב-5 מיליליטר של תמיסת ניקוי CUBIC1 טרייה בצינור חדש של 15 מיליליטר והניחו את הצינור על פלטפורמה מסתובבת בתנור הכלאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שחלקי הרקמה שקופים, שטפו את הביופסיות ב-4 מיליליטר של PBS במשך ארבע שטיפות של 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שטיפה של 4 שעות של 37 מעלות צלזיוס במשקל של 20% לכל נפח סוכרוז ב-PBS.

בתום הדגירה, מקפיאים כל דגימה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית בצינורות בודדים של 15 מיליליטר למשך הלילה במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להגביר את חדירות הרקמות לחדירת נוגדנים.

למחרת בבוקר, להכתים את דגימות העור עם נוגדנים מתאימים וצבעים חיוניים של עניין. לאחר מכן, דגרו את הדגימות במיליליטר 1 של תמיסת ניקוי CUBIC2 טרייה בצינורות 2 מיליליטר על שייקר למשך 24 שעות בתנור 37 מעלות צלזיוס כדי לאזן את אינדקס השבירה של הרקמות.

כאשר הרקמות נקיות, מקמו את הביופסיות לאורך הצד הארוך יותר של החלקות כיסוי זכוכית בודדות כך שכיוון צמיחת זקיק השערה מקביל למשטח ההחלקה של הכיסוי. שים טיפה אחת של תמיסת CUBIC2 על הרקמה. מניחים שתי רצועות בגודל 1 מ"מ על 2 ס"מ של דבק כחול על תלוש כיסוי. לאחר מכן, כסו את הביופסיה בתלוש כיסוי שני.

לאחר מכן, הניחו את תא ההדמיה על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי והזיזו את הרקמה למסלול האור. באמצעות מקור האור המתאים ומסנני אפיפלואורסצנטיות סטנדרטיים, סרוק את הדגימה כדי לזהות אזורי עניין מוכתמים פלואורסצנטית. לאחר מכן, לרכוש תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות של אזורי עניין.

• CUBIC - A tissue clearing and three-dimensional imaging technique for cell visualization.
• CUBIC2 - The solution used to further reduce light scattering, enhances tissue transparency.
• Protein Visualization - Process of marking proteins to visually track their expression levels.
• 3D Sample - Biological sample that can be analyzed in three dimensions.
• CUBIC cleared mouse - Mouse skin sample that's been made transparent by the CUBIC technique.

• Introduce CUBIC - Transparentizes tissue for 3D imaging of cellular proteins (e.g., cubic2).
• Key Concepts - Uses specific chemical solutions to remove light scattering molecules (e.g., theory).
• Underlying Mechanisms - Marker proteins and DNA-binding dyes are used for visualization.
• Connect to Experiment - Describes a step by step procedure of utilizing CUBIC method on mouse skin samples.

• What is the CUBIC and CUBIC2 method and how to make tissue transparent for imaging?
• What are the key concepts behind skin tissue clearing and protein visualization?
• How does the addition of marker proteins and DNA-binding dye aid in cellular visualization?

• Practical Applications - CUBIC method assists in studying skin cell's protein expression (e.g., protein visualization).
• Industry Impact - Biomedical industry benefitting from 3D imaging of cells (e.g., healthcare).
• Societal Importance - Enhanced understanding of cell structure and function (e.g., cubic_video).
• Link to Scientific Advancements - Advances in 3D imaging and pathology analysis.