פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את התפשטות התאים ודפוסי ביטוי החלבון ברמת התא הבודד בתלת מימד ולהעריך במדויק את האנטומיה והפתולוגיה של העור. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האופן שבו מנגנונים תאיים ומולקולריים שולטים בהתפתחות והתחדשות האפידרמיס וכיצד מנגנונים אלה מופרעים במהלך מחלת עור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בפרוטוקול פשוט מבחינה טכנית להדמיית תאים בודדים בביופסיות עור בעובי מלא בתלת מימד בדיוק חסר תקדים.

השיטה גם מקלה על חקירת האינטראקציות בין האפידרמיס לדרמיס בדגימות עור מלאות. בדרך כלל חוקרים חדשים בשיטה זו עשויים להתקשות מעט בהכנת ביופסיות העור השטוחות הקטנות מבלי לפגוע בזקיקי השיער. תדגים את ההליך בטי מקלאריוס, דוקטורנטית ביחידה לדרמטולוגיה התפתחותית ורגנרטיבית ב-UNSW אוסטרליה.

התחל בשימוש בגוזמים כדי לגלח את השיער מצווארו של עכבר שהורדם, תוך הקפדה לא לפצוע את העור. לאחר מכן יש לטהר את העור עם 70% אתנול ו-PBS. לאחר מכן, הרם את עור הצוואר הגבי בעזרת מלקחיים והשתמש במספריים כדי להסיר שטח של כ-1.5 על 4 ס"מ מעור העכבר הגבי.

לאחר מכן משטחים את צד הדרמיס של העור כלפי מטה על פיסת נייר פילטר תוך ציון הכיוון האחורי הקדמי של הדגימה וחותכים את הנייר סביב העור המנותח. להדמיה אופטימלית דגימות העור צריכות להישאר שטוחות עם כיוון זקיק שיער עקבי. כדי לשמור על הדגימות במיקום האחורי הקדמי הנכון אנו מקבעים את חלקי העור על נייר הסינון בביופסיות מלבניות.

העבירו את הדגימות לצינור של 15 מ"ל מלא ב-4% PFA ו-PBS טריים. לאחר מכן, כאשר הם מקובעים היטב לנייר הסינון, העבירו את הדגימות לצינור חדש של 15 מ"ל של PBS לשתי כביסות של חמש דקות. כדי לנקות את ביופסיות העור, לאחר השטיפה השנייה השתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך את הרקמות לחתיכות בגודל של כ-0.2 על 0.5 ס"מ תוך הקפדה על חיתוך הצדדים הארוכים יותר של הדגימות לאורך הכיוון האחורי הקדמי של הדגימות.

חיתוך לאורך צד הביופסיה במקביל לכיוון זקיקי השיער מסייע גם במניעת נזק נרחב לזקיקי השיער. הם טובלים את הביופסיות ב-5 מ"ל של תמיסת פינוי אחת מעוקבת שהוכנה לאחרונה בצינור חדש של 15 מ"ל ומניחים את הצינור על פלטפורמה מסתובבת בתנור הכלאה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שחתיכות הטישו שקופות, שטפו את הביופסיות ב-4 מ"ל PBS למשך ארבע, שש שעות, שטיפות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטיפה של ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-20% משקל לנפח, סוכרוז ו-PBS.

בתום הדגירה הקפיאו כל דגימה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית בצינורות בודדים של 15 מ"ל למשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס כדי להגביר את חדירות הרקמות לחדירת נוגדנים. למחרת בבוקר יש להכתים את דגימות העור בנוגדנים המתאימים ובצבעים חיוניים מעניינים. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-1 מ"ל של תמיסת פינוי מעוקבת טרייה שהוכנה בצינורות של 2 מ"ל על שייקר למשך 24 שעות בתנור 37 מעלות צלזיוס כדי לאזן את מקדם השבירה של הרקמות.

כאשר הרקמות פנויות, הביופסיות לאורך הצד הארוך יותר של כיסוי הזכוכית הבודד מחליקות כך שכיוון צמיחת זקיק השיער מקביל למשטח החלקת הכיסוי. שים טיפה אחת של תמיסה מעוקבת שתיים מעל הרקמה. הניחו שתי רצועות של 1 מ"ל על 2 ס"מ של דבק כחול על פתק כיסוי, ולאחר מכן כסו את הביופסיה עם פתק כיסוי שני.

לאחר מכן, הנח את תא ההדמיה על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי והעבר את הרקמה למסלול האור. באמצעות מקור האור המתאים ומסנני אפיפלואורסצנציה סטנדרטיים, סרוק את הדגימה כדי לזהות אזורי עניין מוכתמים פלואורסצנטיים ולאחר מכן רכוש תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות של אזורי העניין. בשיטה זו ניתן להבהיר ביופסיות עור גב בעובי של עכברי בר בוגרים ולהכתים אותן בנוגדנים כנגד סמן הקרטינוציטים הבסיסי קרטין 14.

גרעינים חיוביים דפים נראים בכל הדגימה ומאפשרים הערכה של חלק מהמאפיינים האנטומיים כגון הפפילות העוריות. צביעת K14 ניכרת בשכבת הבסיס בעובי תא אחד של האפידרמיס הבין-זקיקי. מתאר את בלוטות החלב ומעטפת השורש החיצונית של זקיקי השיער ובחיידקי השיער המשניים עם רמות נמוכות בלבד של ביטוי K14 שזוהו באזור הבליטה של זקיקי השיער.

כדי לדמיין את התאים המתרבים, ניתן להבהיר ולצבוע ביופסיות עור גב בעובי מלא בטלוגן של עכברי בר בוגרים, כפי שהוכח, וחושף את נוכחותם של קרטינוציטים מתרבים באפידרמיס הבין-זקיקי הבסיסי ובאיסטמוס אך לא באזור הבליטה של זקיקי השיער. כדי לדמיין את בלוטות החלב ניתן להבהיר ולהכתים ביופסיות עור גב בעובי מלא באנטיגן של עכברי בר בוגרים, מה שמקל על זיהוי בלוטות החלב באזור האיסטמוס של זקיקי השערה. כדי לדמיין שינויים מורפולוגיים באפידרמיס ובבעלי חיים טרנסגניים, ניתן להבהיר ולצבוע ביופסיות עור גב בעובי מלא, לחשוף היפרפלזיה של האפידרמיס הבין-זקיקי וזקיקי שיער חריגים עם מסות תאים מסומנות K14 המשתרעות קרוב לתוך הדרמיס המייצג את אוכלוסיות תאי הגזע הטרנסגניות המוגדלות.

לאחר צפייה בסרטון זה אנו אמורים להבין היטב כיצד להכין ולהבהיר דגימות עור ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון ברזולוציה של תא בודד בתלת מימד. שיטה זו פשוטה לביצוע ומשתמשת בריאגנטים בטוחים וזולים יחסית. בעתיד ייבדקו נוגדנים נוספים להתאמה שלהם לשיטה זו, מה שיאפשר להרחיב את הניתוח הזה כדי להמחיש יותר חלבונים וסוגים מסוימים של עניין.

ניתן לבצע שיטות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופ גיליון אור להדמיה של אנטומיה של העור ודפוסי ביטוי חלבון של דגימות עור גדולות יותר בתלת מימד. לאחר פיתוחה טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העור לחקור את האינטראקציות התאיות והמולקולריות בין הדרמיס לאפידרמיס בהומאוסטזיס של העור, במודלים של עכברים מהונדסים גנטית ובאחד המודלים שלנו למחלות עור.