יצירת נויטרופילים הקשורים לגידולים אנטי-אנגיוגניים

קח גידול מלנומה של עכברים המורכב מניטרופילים הקשורים לגידול, או TANs.

TANs מציגים פעילות מוגברת של האנזים ניקוטינאמיד פוספוריבוסילטרנספראז, או NAMPT, הממריץ אנגיוגנזה, התפשטות כלי דם בגידולים ומקל על צמיחת הגידול.

טוחנים את הרקמה ומוסיפים אנזימים כדי לפרק את מטריצת הרקמה, ומשחררים את התאים.

סנן את המתלה דרך מסננת וצנטריפוגה כדי לגלול את התאים.

הוסף מאגר ליזינג כדי ליז את כדוריות הדם האדומות, ואז צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט המכיל פסולת תאים.

הכנסת נוגדנים לחסימת קולטני Fc תאיים, ובכך הימנעות מצביעת חיסון לא ספציפית.

הציגו קוקטייל נוגדנים עם תווית פלואורופור ספציפי לסמני פני השטח על TANs וצבע להבחנה בין תאים מתים.

באמצעות FACS, בודדו את השיזופים הברי קיימא המסומנים בפלואורופור והעבירו אותם למיקרו-פלטה.

הוסף מעכב החוסם את פעילות NAMPT לבארות נבחרות ודגר.

השתמש בתאים כדי להעריך את יכולת הגירוי שלהם לאנגיוגנזה. ה-TANs שטופלו במעכבים מראים אנגיוגנזה מופחתת בהשוואה ל-TANs שלא טופלו.

לבידוד נויטרופילים הקשורים לגידול, הנח חמישה גידולים לבאר לבארות בודדות של צלחת סטרילית של שש בארות, בזמן שהם נקצרים, והשתמש במספריים סטריליים כדי לטחון את הגידולים לחתיכות של 2 עד 3 מילימטרים. לאחר מכן, עכל את שברי הגידול עם 1 מיליליטר של קולגנאז מבוסס דיסק, תמיסת DNase I למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם לחות, ערבוב הדגימות עם מזרק של 10 מיליליטר כל 15 דקות.

בתום הדגירה יש לסנן את התאים דרך מסננות של 100 מיקרומטר לצינור אחד של 15 מיליליטר לבאר כדי להסיר את הסיבים הלא מעוכלים, ולהוסיף PBS לנפח סופי של 15 מיליליטר. אסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה, וליז את כדוריות הדם האדומות עם 1 מיליליטר של מאגר ליזה לכל צינור.

לאחר הערבוב, שלב את התוכן מכל צינור לצינור יחיד של 15 מיליליטר, ועצור את התגובה לאחר שתי דקות עם 11 מיליליטר של מדיום שלם של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של PBBS, וחסמו כל קשירה לא ספציפית עם שלושה מיקרוליטרים של נוגדן חסום FC למשך 15 דקות על קרח.

בתום הדגירה, סמנו את התאים בנוגדנים נגד CD11b ו-Ly6G וכל נוגדן אחר מעניין בתוספת DAPI לדגירה של 30 דקות על קרח מוגן מאור. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב-14 מיליליטר PBS, ולהשעות מחדש את הכדורים ב-1 x 10⁷ תאים למיליליטר של ריכוז בינוני שלם טרי על קרח.

לאחר מכן, מיין את הנויטרופילים החיוביים ל-CD11b Ly6G עם DAPI גבוה על סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי על פי פרוטוקולי מיון סטנדרטיים, ובודק את טוהר הנויטרופילים המבודדים על ציטומטר הזרימה בסוף המיון. עבור עיכוב נויטרופילים הקשור לגידול במבחנה, זרעו 1.5 פעמים 10 עד החמישי מיינו נויטרופילים לכל אחת משתי בארות של צלחת U תחתונה של 96 בארות, והוסיפו FK866 לריכוז סופי של 100 ננו-מולרי בתווך שלם לבאר אחת ונפח שווה של מדיום שלם בלבד לבאר השנייה. לאחר שעתיים בחממת תרבית התאים, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, והשעו מחדש את הכדורים ב-PBS בריכוז המתאים להזרקה שלאחר מכן.