זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות במהירות נוכחות של חיידקים ספציפיים כגון אי קולי באמצעות גניק שפעת חדש, DNA, בדיקות Zyme תחילה, DNA גנטי שלם. בדיקות Zyme נוצרות על ידי קשירה. לאחר מכן מתרבית חיידקים כדי להעשיר את מספר מולקולות המטרה ומכינים תערובת חוץ-תאית מצטברת מהסופרנטנט.

לאחר מכן, התערובת החוץ-תאית הגולמית משולבת עם אינטראקציה של בדיקת ה-DNA Zyme בין בדיקת ה-DNA Zyme למולקולות המטרה מביאה לפיצול של הגשושית, שלאחר מכן משתמשת ב-fluoresces. אינטראקציה פלואוריומטרית בין הגשושית למטרה נתפסת כעלייה בקרינה היחסית. לאחר מכן התוצאות מאומתות באמצעות ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מבוססות PCR או נוגדנים הוא שההליך פשוט וקל יותר לביצוע. למרות ששיטה זו פותחה עם חיידק המודל e coli, ניתן ליישם אותה לאיתור כל פתוגן חיידקי אחר הנישא במזון או נוסוקומיאלי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם עשויים שלא להיות רגילים לטיפול בבדיקות DNA סינתטיות וחיידקים מדגימים את ההליך הוא סרג'יו אגייר, עוזר מחקר מהמעבדה שלי ומונסו עלי, עמית פוסט-דוקטורט לפרוטוקול זה.

R-F-D-E-C אחד הוא ה-DNA Zyme המוצג. הוא מורכב מהרצף הקטליטי EC אחד המסומן בקו תחתון בשחור ורצף המצע FS אחד המסומן בקו תחתון ירוק הכלול בתוך המצע הוא קישור RNA המסומן על ידי ה-r הכחול המסומן על ידי Fluor המסומן על ידי ה-F ו-QUENCHER המסומן DT המצוין על ידי התור RF SS אחד הוא גרסה מקושקשת של RFD EEC אחד שבו הרצף הקטליטי EEC אחד מעורבב חלקית ל-SS אחד, אבל החלק האחד של ה-FS נותר ללא שינוי. RF DEC אחד ו-RF SS אחד מיוצרים על ידי קשירה אנזימטית בתיווך תבנית של האוליגונוקלאוטיד FS אחד עם אוליגונוקלאוטיד EC אחד או SS אחד בנוכחות LT אחד כתבנית קשירה להכנת תערובות חוץ-תאיות גולמיות או cems שישמשו כמטרה ל-R-F-D-E-C אחד מתחיל בחלוקת שני מיליליטר של LB לצינורות תרבית סטריליים של 14 מיליליטר באמצעות אקדח פיפטה.

לאחר מכן, בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחרו מושבה אחת של אי קולי מצלחת מקדחה וזרקו אותה לתוך צינור תרבית המכיל lb. מניחים את הצינורות באינקובטור המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ומנערים ב -250 סל"ד למשך 14 שעות לאחר הדגירה. כדי ליצור תרבית חיסון מחדש של 1%, חלק שני מיליליטר LB טרי לצינורות תרבית של 14 מיליליטר והוסף 20 מיקרוליטר מתרבית החיידקים מהשלב הקודם.

דגרו את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד עד שכל תמיסה חיידקית מגיעה ל-OD 600 של העברה אחת בערך. מיליליטר אחד מכל תרבית לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר וגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-11,000 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב העבירו את הסופרנטנט השקוף לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

אחסן את הסופרנטנט במינוס 20 מעלות צלזיוס. אם הוא לא ישמש באופן מיידי כדי לקבוע אם אות פלואורסצנטי נוצר עם אינטראקציה של אנזימי ה-DNA עם תמצית התא הגולמי, הדגימות נבדקות על ידי פוטומטריית ספקטרום. הפעל ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי והגדר פרמטרים לרכישת נתונים עם עירור ב-488 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר.

הגדר גם את המכשיר לקריאות כל דקה למשך שעה. שטפו שלוש קובטות קריסטל קוורץ תחילה במים מזוקקים נטולי יונים ולאחר מכן עם 100% אתנול. יבש את הקובטות על ידי הבהוב גז חנקן.

סמן את הקובטות כ-C אחד לבקרה אחת C שתיים לבקרה שתיים ו-T לבדיקה הבאה להעביר 24 מיקרוליטר של מים מזוקקים נטולי יונים ל-C אחד ו-24 מיקרוליטר של התערובת החוץ-תאית הגולמית המוכנה אי קולי ל-C שתיים ו-T.הוסף 25 מיקרוליטר של שני X RB לכל וטרינר Q והנח אותם בספקטרופוטומטר הפלואורסצנטי. התחל לאסוף נתוני פלואורסצנטיות לאחר חמש דקות, הוסף מיקרוליטר אחד של חמישה RFS מיקרומולריים S אחד ל-C שניים ומיקרוליטר אחד של חמש מיקרומולר, RFD eec אחד ל-T ו-C אחד כדי להבטיח שקריאות הקרינה לא יופרעו. מערבבים כל תמיסה על ידי פיפטה, ואז מאפשרים לתגובה להימשך למשך שארית תקופת הרכישה.

שמור את הנתונים בפורמט קובץ Excel. לאחר מכן העבר את הנתונים למחשב אישי והשתמש באקסל כדי ליצור תמונה גרפית. אותן תערובות תגובה ששימשו לניתוח על ידי ספקטרה.

ניתן להשתמש בפוטומטריה לניתוח על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. לאחר שעה של רכישה. הסר את הקובטות מהספקטרופוטומטר והעביר את התמיסות לצינורות מיקרו צנטריפוגה חדשים.

להרוות את התגובות על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של שלושה נתרן אצטט מולארי ו-125 מיקרוליטר של 100% אתנול. מערבבים כל תמיסה במערבולת ומניחים את הצינורות במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר צנטריפוגת הדגירה. תערובות התגובה ב -11, 000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ומסירים בזהירות את הסופרנטנט על ידי פיפטינג.

יבש את הכדורים באמצעות רכז DNA למשך 10 דקות. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר טעינת ג'ל ומערבולת קצרה. סובב לזמן קצר עם צנטריפוגה על הספסל.

לאחר מכן טען 10 מיקרוליטר מדגימות התגובה לבאר של 10% ג'ל Dage לאחר הריצה. הסר את צלחות הזכוכית ושטוף היטב במי ברז. כדי להסיר חתיכות ג'ל, נגב את הצלחות במגבון קים.

סרוק את לוחית הג'ל לאיתור פלואורסצנטיות באמצעות סורק טייפון. נתח את התמונות המתקבלות באמצעות תוכנת כמויות תמונה כדי להעריך את רגישות המערכת. תרביות מדוללות סדרתיות גדלות לפרקי זמן הולכים וגדלים.

כדי לקבוע את תקופת הדגירה המינימלית הנדרשת לאיתור חיידק בודד, הכינו 10 צינורות תרבית המכילים שני מיליליטר של lb מחסנים כל תרבית ב-100 מיקרוליטר של שני CFU למיליליטר של מלאי גליצרול של אי קולי ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד ב-4, 8, 12, 16 ו-24 שעות. קצור 300 מיקרוליטר מכל אחד מצינורות התרבות המחוסנים מכיוון שייתכן שלא יהיו חיידקים הניתנים לזיהוי עבור דגימות שנקטפו בזמן. נקודות 4 8 12.

אפשרו לתרבית הנותרת לגדול במשך 24 שעות על מנת לזהות תרביות המכילות חיידקים. מדוד את ה-OD 600 וזרז את התאים על ידי צנטריפוגה ב-11,000 גרם למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את ה-CEMS לצינורות מיקרו צנטריפוגות טריים של 1.5 מיליליטר, ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש למחרת.

בדוק את התרבויות לצמיחה. רק אחת או שתיים מתוך 10 התרביות עשויות להכיל אי קולי לאחר החיסון והצינורות הנותרים לא יכילו תאים. השתמש ב-CEMS שהתאושש מתרביות חיוביות בנקודות הזמן המיועדות להכנת תגובות מחשוף עם RFD EEC one, נתח את תערובות התגובה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל DAGE כפי שתואר קודם לכן, בדיקות RFD EEC one ו-RF SS one הוכנו על ידי קשירה אנזימטית של חלקי ה-DNA למצע.

FS אינטראקציה אחת של CEM EEC ו-RFD EEC אחת או RF SS אחת הוערכה לאחר מכן על ידי ספקטרומטריה. כפי שניתן לראות כאן. R-F-D-E-C אחד ייצר רמה גבוהה של אות פלואורסצנטי עם הוספת CEM ec.

בניגוד מוחלט, R FS S אחד לא הפיק אות פלואורסצנטי חזק. לפיכך, הפונקציה המייצרת הקרינה של RFD EEC one. עם יצירת קשר עם CEM EC רצף.

ספציפי כדי לוודא שהעלייה הקרינה שנצפתה נבעה מפיצול קישור ה-RNA. תערובות התגובה נותחו על ידי מחשוף דג' של RFD eec, נתרן הידרוקסיד אחד על 0.25 מולרי צפוי ליצור שברי NA דו-ממדיים, שבר של חמישה ראשוניים השומר על הפלואור ושבר תלת-ראשוני השומר על המרווה. כפי שניתן לראות כאן.

תערובת התגובה RFD EEC CEM EEC אכן ייצרה את תוצר המחשוף הצפוי. יתר על כן, רק UNC חתך את R-F-D-E-C אחד ואת המקטע בעל חמשת הראשונים ניתן היה לזהות על ידי הדמיה פלואורסצנטית. כדי לבחון את הספציפיות של RFD EEC בוצעו בדיקות פלואורסצנטיות אחת באמצעות CEMS שנאספו ממספר חיידקים גראם שליליים וגראם חיוביים אחרים בלבד.

הדגימה המכילה CEM EC הפיקה עלייה בקרינה. היעדר תגובתיות צולבת עם CEMS מהחיידקים האחרים מצביע על כך ש-R-F-D-E-C הוא סלקטיבי ביותר עבור אי קולי כדי לקבוע את זמן התרבית המינימלי הנדרש לאיתור אי קולי יחיד של תא אי קולי מדולל ל-CFU אחד למיליליטר ב-100 מיקרוליטר שגודלו עם מצע גידול למשך 4, 8, 8, 12, 16 ו-24 שעות. ה-CEMS שהתקבל מעורבב עם R-F-D-E-C אחד והמחשוף הוערך על ידי dage כפי שמוצג כאן.

תמונה של בדיקת Dage מצביעה על כך ש-R-F-D-E-C לא ייצר את תוצר המחשוף הצפוי. כאשר הגיב עם CEM. ECS נאסף בארבע ושמונה שעות של צמיחה, מה שמצביע על כך שיש צורך בזמן תרבית של 12 שעות לאחר שליטה.

המרכיב העיקרי בטכניקה זו שבדיקה מבוססת אנזים DA יכולה להיעשות תוך 60 דקות אם היא מבוצעת כראוי לאחר התפתחות זו. ההליך סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביו-אנליזה לחקור אנזימי DNA אלוגניים לזיהוי מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים.