זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות במהירות נוכחות של חיידקים ספציפיים, כגון e coli, באמצעות גששים חדשניים מסוג flu genic, DNA, Zyme. ראשית, גששי genic DNA. Zyme נוצרים על ידי ליגציה. לאחר מכן, החיידקים מורבים כדי להגדיל את מספר מולקולות המטרה, ומיחזור חוץ-תאי מוכן מהעלתו.

לאחר מכן, מערבבים את התערובת הגולמית החוץ-תאית עם גשש ה-DNA zyme. האינטראקציה בין גשש ה-DNA zyme לבין מולקולות המטרה גורמת לשסוע של הגשש, אשר לאחר מכן פולט פלואורסצנציה. את האינטראקציה בין הגשש למטרה מזהים באמצעות פלואורימטר כעלייה פלואורסצנציה יחסית. התוצאות מאומתות לאחר מכן באמצעות אנליזה של אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד דנטורטיבי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני PCR או שיטות מבוססות נוגדנים הוא שההליך פשוט יותר וקל יותר לביצוע. אף ששיטה זו פותחה עבור חיידק המודל e coli, ניתן להחילה לזיהוי של פתוגנים חיידקיים אחרים המועברים במזון או נרכשים בבתי חולים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה כיוון שייתכן שאינם מורגלים בטיפול במ probes של DNA סינתטי ובחיידקים. את ההליך מדגימים Sergio Aguire, עוזר מחקר מהמעבדה שלי, ו-Monso Ali, עמית פוסט-דוקטורט, עבור פרוטוקול זה.

R-F-D-E-C one הוא ה-DNA Zyme המודגש. הוא מורכב מהרצף הקטליטי EC one המסומן בקו שחור ומרצף הסובסטרט FS one המסומן בקו ירוק; בתוך הסובסטרט נמצא קישור RNA המסומן על ידי ה-r הכחול, המוקף ב-DT מסומן פלואורסצנט המצוין על ידי ה-F וב-DT מסומן QUENCHER המצוין על ידי ה-queue. RF SS one הוא גרסה מבולגנת של RFD EEC one, שבה הרצף הקטליטי EEC one מעורבב חלקית לתוך SS one, אך חלק ה-FS one נשאר ללא שינוי. RF DEC one ו-RF SS one מיוצרים על ידי ליגציה אנזימטית בתיווך תבנית של האוליגונוקלאוטיד FS one עם האוליגונוקלאוטיד EC one או SS one בנוכחות LT one כתבנית ליגציה, כדי להכין תערובות חוץ-תאיות גולמיות (cems) שישמשו כמטרה עבור R-F-D-E-C one. התחילו בהעברה של 2 mL של LB למבחנות תרבית סטריליות של 14 mL באמצעות פפיט גן (pipette gun).

בשלב הבא, בעזרת טיפ פיפטה סטרילי, קחו מושבה אחת של e coli מלוח אגר והעבירו אותה למבחנה תרבית המכילה LB. הניחו את המבחנות באינקובטור המכוון ל-37 °C ונקנעו במהירות של 250 RPM למשך 14 שעות לאחר ההדגרה. כדי להכין תרבית חיסון של 1%, העבירו 2 mL של LB טרי למבחנות תרבית של 14 mL והוסיפו 20 µL מתרבית החיידקים מהשלב הקודם.

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 250 RPM עד שכל תמיסה חיידקית מגיעה ל-OD 600 של כ-1. העבירו 1 mL מכל תרבית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL ורוסקו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-11,000 G למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, העבירו את העלייה הצלולה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL.

שמרו את תסמיך העל בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. אם התסמיך לא ישמש באופן מיידי כדי לקבוע האם נוצר אות פלואורסצנציה כתוצאה מאינטראקציה של אנזימי ה-DNA עם תמצית התאים הגולמית, יש לבחון את הדגימות באמצעות ספקטרופוטומטריה. הפעילו את הספקטרופוטומטר הפלואורסצנטי והגדירו את פרמטרי רכישת הנתונים עם עירור ב-488 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר.

כמו כן, הגדירו את המכשיר לביצוע קריאות בכל דקה למשך שעה אחת. שטפו שלוש קובטות של קריסטל קוורץ תחילה במים מזוקקים ודה-יוניים ולאחר מכן ב-100% ethanol. ייבשו את הקובטות באמצעות נשיפת גז חנקן.

סמנו את הקובטות כ-C1 עבור ביקורת אחת, C2 עבור ביקורת שתיים ו-T עבור דגימת הבדיקה. לאחר מכן, העבירו 24 µL של מים מזוקקים ודה-יוניזים ל-C1, ו-24 µL של תערובת ה-crude extracellular שהוכנה מ-e coli ל-C2 ול-T. הוסיפו 25 µL של 2X RB לכל קובטה והניחו אותן בספקטרופוטומטר הפלואורסצנציה. התחילו באיסוף נתוני פלואורסצנציה ולאחר חמש דקות, הוסיפו 1 µL של 5 µM RFSS1 ל-C2, ו-1 µL של 5 µM RFDEEC1 ל-T ול-C1, תוך הבטחה שקריאות הפלואורסצנציה לא יופסקו. ערבבו כל תמיסה באמצעות פיפוט, ולאחר מכן אפשרו לתגובה להימשך למשך שאר תקופת הרכישה.

שמרו את הנתונים בפורמט קובץ Excel. לאחר מכן, העבירו את הנתונים למחשב אישי והשתמשו ב-Excel כדי ליצור תמונה גרפית. אותן תערובות תגובה ששימשו לניתוח באמצעות Spectra.

ניתן להשתמש בפוטומטריה עבור ניתוח באמצעותאלקטרופורזה של ג'ל. לאחר שעה של רכישת נתונים, הוצא את הקובטות מהספקטרופוטומטר והעבר את התמיסות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות.

עצרו את התגובות על ידי הוספה של 5 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-125 µL של 100% ethanol. ערבבו כל תמיסה באמצעות וורטקס והניחו את המבחנות במקפיא בטמפרטורה של 20- °C למשך שעה אחת לאחר סיום הדגירה. סבבו את תערובות התגובה בצנטריפוגה ב-11,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C והסירו בזהירות את תסמין העל באמצעות פיפטה.

ייבשו את הכופליות באמצעות מרכז DNA למשך 10 דקות. הוסיפו 20 µL של תמיסת טעינה לג'ל וערבבו קצרה במכשיר וורטקס. סובבו קצרות בצנטריפוגה שולחנית.

בשלב הבא, טענו 10 µL של דגימות התגובה לכל באר בג'ל 10%Dage לאחר ההרצה. הסירו את לוחיות הזכוכית ושטפו אותן ביסודיות במי ברז. כדי להסיר שאריות ג'ל, נגבו את הלוחיות עם נייר Kim wipe.

סרוק את פלטת הג'ל לאיתור פלואורסצנציה באמצעות סורק typhoon. נתח את התמונות שהתקבלו באמצעות תוכנה לכימות תמונות (image quant) כדי להעריך את רגישות המערכת. תרביות בדילול סדרתי גודלו למשכי זמן הולכים וגדלים.

כדי לקבוע את תקופת הדגירה המינימלית הנדרשת לזיהוי של חיידק בודד, הכין 10 מבחנות תרבית המכילות 2 mL של LB. ניתן לכל תרבית 100 µL ממלאי גליצרין של E. coli בריכוז של 2 CFU/mL, והדגר אותן בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 250 RPM למשך 4, 8, 12, 16 ו-24 שעות. אסוף 300 µL מכל אחת ממבחנות התרבית המוחדרות, שכן ייתכן שלא יזוהו חיידקים בדגימות שנאספו בנקודות הזמן 4, 8 ו-12.

אפשרו לתרבית הנותרת לגדול במשך 24 שעות כדי לזהות תרביות המכילות חיידקים. מדדו את ה-OD 600 ושקיעו את התאים על ידי סריפוגציה ב-11,000 G למשך חמש דקות. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) המכיל את ה-CEMS למבחנות מיקרו-צנטריפוגה טריות בנפח 1.5 מיליליטר, ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש למחרת.

בדקו את התרביות כדי לזהות צמיחה. רק אחת או שתיים מתוך 10 התרביות עשויות להכיל e coli לאחר ההזרקה, ושאר המבחנות לא יכילו תאים כלל. השתמשו ב-CEMS שהופקו מתרביות חיוביות בנקודות הזמן שנקבעו כדי להכין תגובות פילוח עם RFD EEC one, ונתחו את תערובות התגובה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל DAGE כפי שמתואר קודם לכן; הן הגששים RFD EEC one והן RF SS one הוכנו על ידי ליגציה אנזימטית של חלקי ה-DNA zyme לסובסטרט.

לאחר מכן נבחנה אינטראקציה אחת של CEM EEC עם RFD EEC one או RF SS one באמצעות ספקטרומטריה. כפי שניתן לראות כאן, R-F-D-E-C one הפיק אות פלואורסצנציה חזק עם הוספת CEM ec.

בניגוד גמור לכך, R FS S one לא הפיק אות פלואורסצנציה חזק. לפיכך, תפקוד ייצור הפלואורסצנציה של RFD EEC one. עם מגע עם CEM EC מבוצע ריצוף.

במטרה לוודא כי העליות שנצפו בפלואורסצנציה נבעו מפירוק הקישור של ה-RNA. תערובות התגובה נותחו על ידי פירוק של RFD eec; פירוק באמצעות 0.25 molar sodium hydroxide צפוי להניב מקטעי 2D NA, מקטע 5' השומר על הפלואור ומקטע 3' השומר על המכבה. כפי שניתן לראות כאן.

תערובת התגובה RFD EEC CEM EEC אכן הניבה את תוצרי השסוע המצופים. יתרה מכך, רק UNC שסע את R-F-D-E-C one, ואת הפרגמנט של הקצה חמש-פריים ניתן היה לזהות באמצעות דימוי פלואורסצנטי. כדי לבחון את הספציפיות של RFD EEC one, בוצעו בדיקות פלואורסצנציה באמצעות CEMS שנאספו מחיידקים גרם-שליליים וגרם-חיוביים אחרים בלבד.

המדגם המכיל CEM EC גרם לעלייה בפלואורסצנציה. היעדר תגובת הצלבה עם CEMS מחיידקים אחרים מעיד על כך ש-R-F-D-E-C one סלקטיבי מאוד ל-e coli. כדי לקבוע את זמן התרבית המינימלי הנדרש לגילוי תא e coli בודד, הופרד e coli לריכוז של CFU 1 למיליליטר ב-100 µL, אשר תורבדו במצע גידול למשך 4, 8, 12, 16 ו-24 שעות. ה-CEMS שהתקבלו עורבבו עם R-F-D-E-C one, והשסוע הוערך באמצעות dage כפי שמוצג כאן.

תמונה של בדיקת Dage מצביעה על כך ש-R-F-D-E-C one לא ייצר את תוצר הפיצול הצפוי. כאשר הגיב עם CEM, נאספו ECS בשעות ארבע ושמונה לצמיחה, מה שמעיד על כך שנדרש זמן תרבית של 12 שעות לאחר השליטה בתהליך.

מרכיב המפתח של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הבדיקה המבוססת על אנזים DA בתוך 60 דקות אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוח זה. הפרוצדורה סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביואנליזה לחקור אנזימי DNA אלוגניים לזיהוי של מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים.